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双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用 认领
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作者 徐倩 汪沙 +3 位作者 刘麒薇 吕承晓 甘露 柳鑫 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第1期53-57,共5页
目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGA... 目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。 展开更多
关键词 双荧光素酶报告基因系统 hsa-miR-1291 ARHGAP29 宫腔粘连
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利用双荧光素酶报告系统鉴定小鼠Vamp8基因启动子核心区域及转录调控元件 认领
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作者 张书玮 曹诚 刘萱 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第11期839-845,共7页
目的通过构建小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区荧光素酶报告质粒,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区域及转录调控元件。方法通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库和真核生物启动子数据库(EPD),获取包含可能的启动子及转录... 目的通过构建小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区荧光素酶报告质粒,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区域及转录调控元件。方法通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库和真核生物启动子数据库(EPD),获取包含可能的启动子及转录调节区域的小鼠Vamp8基因序列(-1033~+2330 bp)。以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)基因组DNA为模板,PCR扩增钓取该序列,构建小鼠Vamp8基因启动子荧光素酶报告质粒,通过荧光素酶活性检测,验证其启动子活性。随后,通过截短突变及生物信息学分析,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区和主要转录调控区,以及可能的转录因子。结果成功克隆了小鼠Vamp8基因的转录调控区,构建了5个系列截短的小鼠Vamp8基因启动子荧光素酶报告质粒和3个小鼠Vamp8基因转录调节区荧光素酶报告质粒,测序均正确。通过荧光素酶活性检测、生物信息学分析及验证,发现小鼠Vamp8基因-198~+85 bp区域的启动子活性最高,推测其为小鼠Vamp8基因启动子核心区域;而-1033~-199 bp和-198~-37 bp区域分别存在Vamp8基因转录负调控和正调控元件。转录因子CEBPB可促进Vamp8基因转录,其主要结合位点位于-198~-1 bp,与生物信息学预测相符。结论成功构建了小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区双荧光素酶报告系统,发现小鼠Vamp8基因-198~+85 bp区域为该基因启动子核心区域,-1033~-199 bp和-198~-37 bp区域参与其转录调控。转录因子CEBPB可能通过与小鼠Vamp8基因-198~-1 bp区域的DNA序列结合,促进其转录。上述研究为阐明Vamp8基因转录调控的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 Vamp8基因 启动子 转录调控 双荧光素酶报告系统
39K基因对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和转录的影响 认领 被引量:2
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作者 李俊 张婷 +4 位作者 张媛媛 全滟平 舒特俊 聂作明 于威 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期416-425,共10页
39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)39K基因对病毒复制和转录的具体调控作... 39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚。本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系Bm N细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是Bm NPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度。进一步利用q PCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P〈0.01)。为了进一步了解39K基因对Bm NPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由Bm NPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用。综上所述,可知39K基因不是Bm NPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强。本研究结果将为深入了解Bm NPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒(BmNPV) 39K基因 基因敲除 双萤光素酶报告系统 多角体基因启动子
靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定 认领 被引量:2
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作者 戴丽荷 褚晓红 +2 位作者 路伏增 黄孙平 徐如海 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1281-1289,共9页
本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序... 本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。 展开更多
关键词 ATGL基因 MIRNA 双荧光素酶报告基因系统 3′UTR
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利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA 认领 被引量:1
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作者 吴俊静 彭先文 +3 位作者 乔木 武华玉 刘贵生 梅书棋 《湖北农业科学》 2015年第19期4854-4858,共5页
为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的候选mi RNA,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防治及猪的抗病育种提供新策略,通过3′RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列,生... 为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的候选mi RNA,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防治及猪的抗病育种提供新策略,通过3′RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列,生物信息学分析发现其具有mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b、mi R-4262等mi RNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现,与阴性对照组相比,mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b和mi R-4262均可极显著(P〈0.01)抑制荧光素酶的相对活性,其中mi R-181d抑制效果最佳。 展开更多
关键词 双荧光素酶报告系统 MIRNA CD163基因
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正向和反向SV40 poly(A)信号序列对上游基因表达的影响 认领
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作者 侯兵 金华君 +2 位作者 刘文超 钱其军 吕赛群 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期630-633,共4页
目的研究正向和反向SV40poly(A)信号在3种常用细胞株中对上游基因表达的调控作用,为基因表达研究中载体poly(A)信号的选择提供依据。方法将F-Luc与R-Luc两种荧光素酶基因插入同一质粒,构建带有双荧光素酶报告基因的载体Dual-Luc。在... 目的研究正向和反向SV40poly(A)信号在3种常用细胞株中对上游基因表达的调控作用,为基因表达研究中载体poly(A)信号的选择提供依据。方法将F-Luc与R-Luc两种荧光素酶基因插入同一质粒,构建带有双荧光素酶报告基因的载体Dual-Luc。在F-Luc基因后分别插入正向和反向互补的SV40poly(A)信号序列,得到2个带有不同SV40poly(A)信号的载体Dual-Luc2、Dual-Luc3。将其分别转染常用的3类细胞株293、L-02和HeLa细胞,应用双荧光素酶标仪和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定报告基因(F-Luc)的表达量,以R-Luc基因的表达量作对照。结果成功构建携带正向和反向互补SV40poly(A)序列的双荧光素酶载体Dual-Luc2、Dual-Luc3;双荧光素酶标仪检测表明,在293细胞中,Dual-Luc2、Dual-Luc3的F-Luc/R-Luc比值分别为3.25±0.43、3.03±0.14,差异无统计学意义(P〉0.05);在L-02细胞中,Dual-Luc2、Dual-Luc3的F-Luc/R-Luc比值分别为6.16±0.39、3.83±0.39,差异有统计学意义(P〈0.05);在HeLa细胞中,Dual-Luc2、Dual-Luc3的F-Luc/R-Luc比值分别为1.21±0.10、0.66±0.02,差异有统计学意义(P〈0.05)。RT-PCR检测与荧光素酶检测结果一致。结论不同细胞中poly(A)信号序列对上游基因的调控作用存在差异;poly(A)信号对上游基因的调控作用主要发生于转录水平。 展开更多
关键词 SV40poly(A)加尾信号序列 基因表达 双荧光素酶报告系统
一种在哺乳动物细胞中研究蛋白分子转录激活活性系统的建立 认领 被引量:1
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作者 张浩 周建光 +4 位作者 李杰之 王健 孙玉龙 陈珊 黄翠芬 《遗传学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第11期 983-989,共7页
为了在哺乳动物细胞中建立一套用于研究蛋白分子转录激活活性的系统,首先以质粒pTet-Off和真核表达载体pCDNA3.1B(-)/myc-his为基础,分别构建重组质粒pZHO1(用于插入待测基因并作为该系统的阴性对照)、pZHO2(用于作阳性对照),此外,该系... 为了在哺乳动物细胞中建立一套用于研究蛋白分子转录激活活性的系统,首先以质粒pTet-Off和真核表达载体pCDNA3.1B(-)/myc-his为基础,分别构建重组质粒pZHO1(用于插入待测基因并作为该系统的阴性对照)、pZHO2(用于作阳性对照),此外,该系统还包括质粒pTRE-luc(编码Firefly荧光素酶报道基因)和质粒pRL-TK(编码Renilla荧光素酶基因,用作内参对照).为验证该系统的可行性,分别将质粒pZHO1、pZHO2、pZHO3(编码p53分子N端转录激活区73个氨基酸片段,作为实验组)与质粒pTRE-luc和pRL-TK共转染至C4-2、MCF-7、COS7 3种不同的细胞株中,通过检测各转染组细胞中Firefly荧光素酶相对活性的大小来判断该系统的可行性.结果表明,所构建的系统可以在哺乳动物细胞中检测目的分子的转录激活活性. 展开更多
关键词 哺乳动物细胞 蛋白分子 转录激活活性 双荧光素酶报道系统 TET-OFF
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miRNA-326作用于其靶基因BCL-XL的研究 认领
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作者 谯铭铭 盖厦 +5 位作者 叶辉 姬艳博 于媛 陈元锋 徐慧聪 庄云龙 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 2020年第9期987-990,共4页
目的研究miRNA-326是否作用于其靶基因BCL-XL,探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统,分别构建含有BCL-XL 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段的野... 目的研究miRNA-326是否作用于其靶基因BCL-XL,探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统,分别构建含有BCL-XL 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段的野生型和变异型的双荧光素酶载体,设置对照组,转染细胞检测相对荧光强度。结果分别构建了PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT(野生型)和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT(变异型)的双荧光素酶报告基因质粒载体;miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染测定的相对荧光强度显著低于对照组(miRNA-326阴性对照序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染组)(P=0.034);同时也显著低于miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT质粒共转染的变异组(P=0.022)。结论miRNA-326作用于BCL-XL基因的3′UTR;这为研究miRNA调控血小板凋亡的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 miRNA-326 BCL-XL基因 3′非翻译区 双荧光素酶报告基因系统
miRNA-570调控ATP合成酶G亚基的表达促进血小板凋亡 认领
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作者 盖厦 李晓华 +6 位作者 徐慧聪 叶辉 谯铭铭 姬艳博 于媛 陈元锋 庄云龙 《中国输血杂志》 CAS 2020年第3期205-212,共8页
目的探讨微小RNA(miRNA)-570对腺苷三磷酸(ATP)合成酶G亚基因(ATP5L)基因表达的影响及miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法依据NCBI数据库中NM006476.5人的序列分别合成ATP5L 3′端非翻译区(UTR)的野生型(WT)序列和突变型(MT)序列(488 ... 目的探讨微小RNA(miRNA)-570对腺苷三磷酸(ATP)合成酶G亚基因(ATP5L)基因表达的影响及miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法依据NCBI数据库中NM006476.5人的序列分别合成ATP5L 3′端非翻译区(UTR)的野生型(WT)序列和突变型(MT)序列(488 bp),通过在序列两端增加限制酶酶切位点,与双荧光素酶报告基因载体(psiCHECKTM-2)质粒连接,分别构建含有ATP5L 3′UTR的WT和MT的双荧光素酶报告基因载体。依据miRNA数据库中MI0003577人的序列分别合成miRNA-570序列和其阴性序列,分别与构建的双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞,依据转染物的不同将实验分为6组,实验组1:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;实验组2:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;阴性对照组1:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;阴性对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;空白对照组1:miRNA-570序列和psiCHECK-2质粒;空白对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-2质粒。转染48 h后利用生物发光检测仪检测转染细胞的相对荧光强度。收集单采血小板60 mL,利用脂质体方法转染血小板,依据转染物的不同,将实验分为4组,实验组A:miRNA-570序列;阴性对照组B:miRNA-570阴性对照序列;空白对照组C:脂质体2000;空白对照组D:空白(无转染物);分别转染转染血小板,24 h后收集血小板,流式细胞仪检测血小板膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻表达,Western blot检测血小板半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达,ELISA方法检测血小板Caspase-3活性。结果分别成功构建了psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT和-MT的双荧光素酶报告基因质粒载体。转染293T细胞测定的相对荧光强度:实验组1、实验组2、阴性对照组1、阴性对照组2、空白对照组1、空白对照组2分别为0.673±0.080、0.967±0.059、0.97±0.076、0.96±0.075、0.97±0.067、1.0±0.1(P<0.05)。实验组A、阴性对照序列组B、空白对� 展开更多
关键词 微小RNA(miRNA)-570 血小板凋亡 ATP合成酶G亚基基因 磷脂酰丝氨酸 半胱氨酸蛋白酶-3 双荧光素酶报告基因系统
PDPK1 3′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证 认领
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作者 余河玲 朱师良 +1 位作者 何启牮 王彦 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第1期147-151,共5页
本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因... 本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。 展开更多
关键词 PDPK1 gga-miR-148a-5p 禽白血病 双荧光素酶报告基因检测系统
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用于细胞水平家蚕转录调控元件研究的简单基础启动子的构建 认领
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作者 顾健健 刘红玲 +7 位作者 李凯荣 孟紫旺 王慧娟 沈关望 张宇靖 阮杨 林英 夏庆友 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期391-397,共7页
【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的... 【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2Element,BrC-Z2E);通过基因克隆技术构建细胞转染载体;通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的变化。【结果】通过在BmVgP78M启动子上游添加28bp间隔序列,成功构建了一个简单基础启动子,命名为VgP78ML,并证明其为可用于研究目标转录调控元件的简单基础启动子。经实验验证表明,该简单基础启动子不仅可以在家蚕细胞中稳定表达,且其本身活性不受20E及转录因子BrC-Z2的影响;当该启动子上游连接BrC-Z2E时,可以显著地应答20E及BrC-Z2转录因子,从而调控报告基因的表达。【结论】VgP78ML能够作为简单基础启动子应用于细胞水平对家蚕基因转录调控进行研究。同时,其构建方法也为其他物种构建研究转录调控的简单基础启动子提供了参考。 展开更多
关键词 家蚕 细胞 简单基础启动子 双荧光素酶报告基因系统 转录调控 转录元件
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miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子基因表达的靶向调控作用 认领 被引量:2
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作者 余丹纯 聂玉强 +1 位作者 黄耀星 孙小娟 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2019年第1期48-51,共4页
目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCA... 目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCAM mRNA的表达情况,确定实验细胞株;通过PCR扩增合成含有miR-9结合位点的ALCAM mRNA 3′端非编码区(ALCAM 3′UTR)片段和在miR-9结合位点进行突变的ALCAM-mut mRNA 3′UTR,测序鉴定后将其克隆至报告基因载体psiCHECK-2质粒,分别命名为psiCHECK-2-ALCAM和psiCHECK-2-ALCAM-mut;分组转染重组质粒和miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达,SYBR Green荧光定量PCR和Western blotting检测ALCAM mRNA及蛋白表达水平。结果生物信息学分析筛选发现miR-9可能靶向调控ALCAM;ALCAM mRNA在各胃癌细胞株中的表达量明显高于人正常胃黏膜GES-1细胞株,且SGC-7901细胞株ALCAM mRNA的表达量最高(P<0.05),确定为实验细胞株;测序验证ALCAM 3′UTR和ALCAM-mut 3′UTR经PCR扩增合成成功;psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-9 mimics细胞组的相对荧光素酶活性较psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-NC、miR-9 inhibitor细胞组或空白对照组明显降低(P<0.05),且该组细胞ALCAM mRNA和蛋白的表达明显降低(P<0.05);而psiCHECK-2-ALCAM-mut质粒共转染miR-NC、miR-9 mimics或miR-9 inhibitor细胞组的相对荧光素酶活性与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论在SGC-7901中,miR-9通过与ALCAM mRNA 3′UTR结合而负性调控ALCAM基因的表达。 展开更多
关键词 胃癌 双荧光素酶报告基因系统 逆转录聚合酶链反应 蛋白质印迹法 MIR-9 活化白细胞黏附分子
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一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建(英文) 认领 被引量:1
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作者 刘红玲 林英 +6 位作者 沈关望 顾健健 张海燕 吴金鑫 徐银莹 龙威 夏庆友 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1631-1641,共11页
双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒... 双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。 展开更多
关键词 家蚕 双荧光素酶报告基因系统 内参质粒 激素 方法
MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响 认领 被引量:4
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作者 邱进 刘辉 +5 位作者 热孜宛古丽·伊敏 袁芳 许瑞 马玲 霍强 周勇 《新疆医科大学学报》 CAS 2017年第5期606-611,616共7页
目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939-+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧... 目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939-+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C〉T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性。数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较。结果成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P〈0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356--108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1� 展开更多
关键词 肌细胞增强因子2 启动子突变 单纯性先天性心脏病 双荧光素酶报告基因系统 维吾尔族人群
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Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用 认领 被引量:1
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作者 钱平 蒋涛 +5 位作者 王欣 宋菲 陈晨 范洋洋 唐顺明 沈兴家 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期826-831,共6页
微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21... 微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P〈0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。 展开更多
关键词 家蚕 丝胶蛋白基因Ser-1 微小RNA Bmo-miR-2771 转录后调控 半定量RT-PCR 双荧光素酶报告基因系统
CYP3A4*1G基因多态性及功能的初步探讨 认领 被引量:1
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作者 贺宝霞 赵秀莉 +1 位作者 石磊 赵树进 《河南医学研究》 CAS 2014年第7期4-7,共4页
采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4* 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4* 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显... 采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4* 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4* 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示,pGL3-promoter-A质粒转染后荧光素酶活性显著高于pGL3-promoter-G(P=0.022< 0.05). CYP3A4* 1G能够增强荧光素酶基因的表达,可能增强CYP3 A4基因的转录活性. 展开更多
关键词 细胞色素P4503A4 基因多态性 双荧光素酶报告基因系统
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转录因子Runx1对Mrgprd基因转录调控的分子机制研究 认领
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作者 黄成成 刘子敬 +3 位作者 曹诚 阳光 杨长亮 甘国胜 《华南国防医学杂志》 CAS 2020年第9期610-614,共5页
目的探索Runx1是否能够结合Mrgprd基因启动子序列,从而直接激活其转录。方法构建包含小鼠Mrgprd基因转录起始点上下游不同序列的一系列Mrgprd荧光素酶报告基因质粒及小鼠Runx1基因的表达质粒,在PC12细胞系中共转染其中一种Mrgprd荧光素... 目的探索Runx1是否能够结合Mrgprd基因启动子序列,从而直接激活其转录。方法构建包含小鼠Mrgprd基因转录起始点上下游不同序列的一系列Mrgprd荧光素酶报告基因质粒及小鼠Runx1基因的表达质粒,在PC12细胞系中共转染其中一种Mrgprd荧光素酶报告基因质粒和Runx1表达质粒或者空载体对照质粒,利用双荧光素酶报告基因系统检测Runx1对这种Mrgprd荧光素酶报告基因的转录激活作用。通过比较Runx1对不同Mrgprd荧光素酶报告基因的转录激活作用的差异,寻找Runx1在Mrgprd基因上发挥调控作用的关键位点。结果 Mrgprd基因转录起始点上游562~200位点序列对于Runx1发挥转录激活作用至关重要,该段序列包含2个Runx1保守结合位点,但这两个位点的突变并不影响Runx1发挥对Mrgprd的转录激活作用。结论 Runx1对Mrgprd基因的转录调控机制可能有多种,并非只是通过结合在Mrgprd基因上游的结合位点来直接调控其转录,也可能通过其他方式间接调控Mrgprd基因的转录。 展开更多
关键词 转录因子 疼痛 RUNX1 双荧光素酶报告系统
靶向调控c-SKI的microRNA的筛选及验证 认领
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作者 王娟 李鹏 +2 位作者 吕忠英 张颖 曹桂秋 《基础医学与临床》 CSCD 2020年第1期60-66,共7页
目的筛选和验证靶向调控c-SKI并与纤维化相关的microRNA(miRNA)。方法生物信息学方法预测并结合文献报道,筛选出靶向c-SKI的候选miRNAs,RT-qPCR检测人心肌成纤维细胞(HCFBs)中候选miRNAs和c-SKI的表达,筛选出抑制作用最显著的miRNA;构建... 目的筛选和验证靶向调控c-SKI并与纤维化相关的microRNA(miRNA)。方法生物信息学方法预测并结合文献报道,筛选出靶向c-SKI的候选miRNAs,RT-qPCR检测人心肌成纤维细胞(HCFBs)中候选miRNAs和c-SKI的表达,筛选出抑制作用最显著的miRNA;构建c-SKI-3′-UTR野生型(c-SKI-wt)和突变型(c-SKI-mut)载体,分别与miR-155a-5p/miR-17a-5p的模拟物、抑制剂及对照在人胚肾上皮细胞(HEK293T)中共转染,双萤光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性;接着,分别将miR-155a/miR-17a-5p mimics和inhibitor转染至人心肌成纤维细胞(HCFBs),Western blot检测各组细胞c-SKI的表达。结果 1)经筛选miR-155a-5p和miR-17a-5p对c-SKI的抑制作用最明显(P<0.01);2)与NC组相比,miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics组萤光素酶活性均显著下降(P<0.05),miR-155a-5p/miR-17a-5p inhibitor组萤光素酶活性均明显增强(P<0.05);3)与NC组相比,miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics组中c-SKI蛋白表达显著下调,miR-155a-5p/miR-17a-5p inhibitor组中c-SKI的表达显著上调(P<0.01)。结论 miR-155a-5p和miR-17a-5p可分别靶向结合c-SKI的3′-UTR,在HCFBs中负性调控c-SKI的表达。 展开更多
关键词 c-SKI miR-155a-5p miR-17a-5p 双萤光素酶报告系统 心肌纤维化
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p53基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miRNA-2127靶向关系的验证 认领 被引量:2
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作者 张玉霞 袁小远 +1 位作者 王友令 孟凯 《山东农业科学》 2019年第1期14-17,共4页
为了验证miRNA-2127与p53基因的靶向关系,利用生物信息学软件预测p53与miRNA-2127的结合位点,全基因合成法合成该结合位点的野生型与突变型模板,并将其克隆到pmiR-RB-REPORT^TM双荧光素酶报告载体中,构建野生型与突变型重组双荧光素酶... 为了验证miRNA-2127与p53基因的靶向关系,利用生物信息学软件预测p53与miRNA-2127的结合位点,全基因合成法合成该结合位点的野生型与突变型模板,并将其克隆到pmiR-RB-REPORT^TM双荧光素酶报告载体中,构建野生型与突变型重组双荧光素酶报告质粒。将293T细胞分为4组,分别共转染野生型报告质粒+阴性对照(NC)、野生型报告质粒+miRNA-2127、突变型报告质粒+NC、突变型报告质粒+miRNA-2127。检测各组细胞中荧光素酶活性差异,结果显示:共转染了野生型报告质粒+miRNA-2127的293T细胞与共转染了野生型报告质粒+NC组相比,荧光素酶活性显著降低(P<0.05);且突变型报告质粒+miRNA-2127组的相对荧光素酶活性显著高于野生型报告质粒+miRNA-2127(P<0.05),说明miRNA-2127能够靶向调控p53基因,且结合位点位于3′UTR区369—375间。 展开更多
关键词 P53 miRNA-2127 双荧光素酶报告系统
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基于雌激素受体调节Nrf2-ARE通路的黄芩中抗氧化成分的筛选 认领 被引量:2
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作者 刘媛媛 刘陶 +4 位作者 吴玉梅 张晗 赵鑫 刘志东 李楠 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期822-827,共6页
目的 建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性... 目的 建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性成分和(或)雌激素受体(ER)特异性抑制剂加入Nrf2-ARE双荧光素酶报告基因系统,检测其是否通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。将筛选出的成分和(或)ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂加入HaCaT细胞中,验证是否通过ER影响Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。结果 黄芩苷(100 μmol·L ^-1 )可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路,诱导表达倍数为空白组的(1.56±0.01)倍( P <0.01)。预给予ER抑制剂后,诱导表达倍数下降至(1.02±0.23)倍,抗氧化作用消失。分别预给予ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂后,黄芩苷干预UVB损伤的HaCaT细胞中的ROS值明显上升,SOD值明显下降。结论 黄芩苷可以通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。 展开更多
关键词 黄芩 抗氧化 Nrf2-ARE通路 植物雌激素受体 双荧光素酶报告基因系统 黄芩苷
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