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牛种布鲁氏菌2308强毒株dsbG基因缺失突变株的构建与初步评价 预览
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作者 杨宁宁 徐明国 +3 位作者 张欢 王奔奔 陈创夫 王震 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期370-375,共6页
目的研究dsbG基因对布鲁氏菌2308毒力的影响。方法以布鲁氏菌2308亲本株为模板,通过同源重组和抗性替代的方法,构建布鲁氏菌dsbG基因缺失株(2308ΔdsbG)。将毒力株2308、疫苗株RB51、2308ΔdsbG缺失株在相同起始浓度下恒温振荡培养,观... 目的研究dsbG基因对布鲁氏菌2308毒力的影响。方法以布鲁氏菌2308亲本株为模板,通过同源重组和抗性替代的方法,构建布鲁氏菌dsbG基因缺失株(2308ΔdsbG)。将毒力株2308、疫苗株RB51、2308ΔdsbG缺失株在相同起始浓度下恒温振荡培养,观察其生长变化趋势;将各菌株按200∶1的感染复数侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8),比较其在胞内的生存能力和粘附侵袭力。结果成功构建并获得了布鲁氏菌dsbG缺失株,且10代内未发现回复现象,遗传性较稳定。2308ΔdsbG缺失株与2308亲本株相比在体外具有相似的生长趋势,但其对宿主细胞的粘附侵袭和胞内的繁殖能力显著低于亲本株。结论dsbG基因在布鲁氏菌的致病能力中发挥重要作用,dsbG基因的缺失显著降低了牛种布鲁氏菌2308的粘附侵袭和胞内生存能力。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 dsbG基因 缺失株
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副猪嗜血杆菌自然转化方法的建立及条件优化 被引量:1
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作者 谨瑾 代科 +8 位作者 文心田 何绿琴 张禄滑 赵玉佳 曹三杰 黄小波 伍锐 赵勤 文翼平 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第12期2058-2065,共8页
自然转化可用于构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)的基因缺失株,对于研究其毒力因子和致病机制有重要的意义。本研究采用控制变量法,对副猪嗜血杆菌自然转化过程中的实验条件进行优化。分别比较了点样时细菌不同生长阶段、... 自然转化可用于构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)的基因缺失株,对于研究其毒力因子和致病机制有重要的意义。本研究采用控制变量法,对副猪嗜血杆菌自然转化过程中的实验条件进行优化。分别比较了点样时细菌不同生长阶段、点样孵化不同时长、转化体系细菌不同浓度、外源环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)不同浓度、外源质粒不同浓度及转化后平板孵化不同时间等条件下的自然转化频率。结果表明,副猪嗜血杆菌的平板转化实验在细菌处于对数生长后期(OD600≈1.5-1.7)时点样孵化,孵化时长为13 h,体系中外源质粒的浓度大于0.1μg/μL,转化后平板孵育5 h时,副猪嗜血杆菌自然转化以较高频率发生。本研究确定了副猪嗜血杆菌自然转化过程中的最佳条件,为副猪嗜血杆菌毒力因子及致病机制等基因功能的相关研究提供了参考。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 基因缺失株 自然转化 转化频率
布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白DK63—887基因缺失株的构建及鉴定 预览
3
作者 江雅丽 陈创夫 +6 位作者 李志强 李默 李爽 王震 张欢 张辉 郭飞 《动物医学进展》 北大核心 2016年第5期30-37,共8页
为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63—887基因缺失株(16MADK63—887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63—887基因,获得突变株16MADK63—887。将亲本株16M、疫苗株M5—90、突变... 为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63—887基因缺失株(16MADK63—887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63—887基因,获得突变株16MADK63—887。将亲本株16M、疫苗株M5—90、突变株16MADK63—887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT—qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63—887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MADK63—887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT—qPCR检测到突变株的ULKI、Beclinl表达量均显著降低(P〈0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁菌 DK63—887基因 缺失株 自噬相关基因
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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BMEI1135基因缺失株的构建及鉴定 预览 被引量:1
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作者 江雅丽 王震 +4 位作者 陈创夫 李爽 李志强 张辉 郭飞 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2016年第5期共7页
为了初步探讨BMEI1135基因在布鲁氏菌感染过程中的作用,以16M为模板利用同源重组和抗性替换的方法,构建羊种布鲁氏菌16M(简称16M)BMEI1135基因缺失株(16M△BMEI1135).将亲本株16M、疫苗株M5-90、缺失株16M△BMEI1135在相同起始浓度下震... 为了初步探讨BMEI1135基因在布鲁氏菌感染过程中的作用,以16M为模板利用同源重组和抗性替换的方法,构建羊种布鲁氏菌16M(简称16M)BMEI1135基因缺失株(16M△BMEI1135).将亲本株16M、疫苗株M5-90、缺失株16M△BMEI1135在相同起始浓度下震荡培养,观察其生长变化趋势;将各菌株置于强酸、强碱、高盐、热休克应激条件下,观察其生存率;侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,比较其在胞内的生存能力,并在不同时间点收集细胞提取RNA,通过qRT-PCR检测自噬相关基因的表达.研究结果显示:成功获得了布鲁氏菌BMEI1135基因缺失株且20代内未发生回复性突变现象.与亲本株相比,16M△BMEI1135在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株体在外界应激条件下生存能力低于亲本株;胞内CFU显示侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降(P<0.01);qRT-PCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P<0.01).本实验的研究结果表明:布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M的胞内生存介导的细胞自噬密切相关,该研究为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础. 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BMEI1135基因 缺失株 自噬相关基因
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三株胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株免疫原性的研究
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作者 张洋溢 谢文浩 +4 位作者 曹三杰 黄小波 文心田 冉曦 张飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期862-870,共9页
为深入研究猪传染性胸膜肺炎基因工程弱毒活疫苗的生物学特性和免疫原性,分别以本实验室构建的血清7型胸膜肺炎放线杆菌(APP)基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和血清5型APP的基因缺失株SW1ΔⅠC为研究对象,对其进行研究。溶血活性... 为深入研究猪传染性胸膜肺炎基因工程弱毒活疫苗的生物学特性和免疫原性,分别以本实验室构建的血清7型胸膜肺炎放线杆菌(APP)基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和血清5型APP的基因缺失株SW1ΔⅠC为研究对象,对其进行研究。溶血活性试验证实,突变株完全失去了溶血活性。细胞毒性试验证实,缺失株SW1ΔⅠC的细胞毒性完全丧失,缺失株apxⅡC-/Kan+和apxⅡC-/ⅠN+有轻微的细胞毒性。遗传稳定性试验证实,3株缺失株在体内传5代均不会发生回复突变。毒力试验结果显示,基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1ΔⅠC对小鼠的半数致死量分别为亲本株的5倍、7倍和15倍。3株缺失株分别免疫小鼠后,以10LD50血清1型、5型和7型APP的剂量攻毒,小鼠的保护率可达100%。试验结果表明,3株缺失株的毒力明显降低,并能提供有效的保护力。本研究为进一步以突变株为基因工程弱毒活疫苗的研究奠定了一定基础。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 基因缺失株 免疫原性
牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株的构建 预览 被引量:10
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作者 张桂红 童光志 +5 位作者 王柳 仇华吉 赵晓岩 张绍杰 于力 刘宝全 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第4期 275-277,共3页
将含有牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)TK基因的片段克隆于pBLuescriptSK中,再用Bg1Ⅱ和SacⅠ切去TK基因中347bp的片段,获得了含缺失TK基因的重组质粒,然后插入LacZ报告基因,构建成转移栽体。... 将含有牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)TK基因的片段克隆于pBLuescriptSK中,再用Bg1Ⅱ和SacⅠ切去TK基因中347bp的片段,获得了含缺失TK基因的重组质粒,然后插入LacZ报告基因,构建成转移栽体。以脂质体转染法将此转移载体与IBRVBarthaV在牛肾细胞上共转染,经过蓝色蚀斑筛选和蚀斑克隆纯化,获得了能稳定遗传的重组IBRV。经PCR和Southern印迹杂交鉴定。证实该重组 展开更多
关键词 IRRV 鼻气管炎病毒 TK基因 基因缺失株
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hrp基因突变体Du728诱导水稻抗白叶枯病的机制研究 预览 被引量:2
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作者 刘凤权 胡白石 王金生 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期 27-31,共5页
以水稻白叶枯病菌野生型菌株JXOⅢ和其hrp基因突变体Du728接种处理汕优63幼苗,测定了处理的第3叶和同株未处理的第4叶中水杨酸(SA)含量以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PO)和几丁质酶(CHT)活性及其相应基因转录活性的变化.接种JXO... 以水稻白叶枯病菌野生型菌株JXOⅢ和其hrp基因突变体Du728接种处理汕优63幼苗,测定了处理的第3叶和同株未处理的第4叶中水杨酸(SA)含量以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PO)和几丁质酶(CHT)活性及其相应基因转录活性的变化.接种JXOⅢ和Du728后,处理叶片和未处理叶片中游离SA含量几乎没有变化,而根中游离SA含量则明显增加.与JXOⅢ处理相比,Du728处理后可迅速提高处理叶片中PAL、PO和CHT的活性,而未处理叶片中这些酶的活性几乎没有变化.处理和未处理叶片中编码这些酶的相应基因(包括查尔酮合成酶基因)转录活性的时序变化与酶活性的变化一致.这些结果表明Du728处理后不能诱导SA在处理和未处理叶片中的积累,处理叶片对白叶枯病的诱导抗性可能与这些基因的快速和高强度的协同表达有关,而未处理叶片抗性的产生与这些酶活性及其相应基因诱导表达无关. 展开更多
关键词 水稻 白叶枯病 抗病机制 hrp基因突变体Du728 诱导抗性
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毒性基因突变体Du728在水稻叶片上的定殖及在植株体内的传导 预览 被引量:2
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作者 刘凤权 王金生 《中国生物防治》 CSCD 2000年第3期 118-122,共5页
研究了毒性基因突变体Du728在水稻叶片的定殖能力及其在植株体内的传导情况。结果表明:Du728可以在水稻叶片和伤口定殖,在叶片上主要定殖于水孔。叶面喷雾后15天内可从处理的叶片中回收到Du728;剪叶接种11天内可... 研究了毒性基因突变体Du728在水稻叶片的定殖能力及其在植株体内的传导情况。结果表明:Du728可以在水稻叶片和伤口定殖,在叶片上主要定殖于水孔。叶面喷雾后15天内可从处理的叶片中回收到Du728;剪叶接种11天内可从伤口分离到目的细菌。但在测定时间内Du728未能从喷雾或剪叶接种的叶片传导至未处理的叶片。Du728菌液拌种后不能从长出的幼菌各部位回收到目的细菌,但Du728可从根系伤口进入根系, 展开更多
关键词 毒性基因突变体 Du728 水稻 定殖 植株传导
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羊布鲁菌16MUGPase基因缺失株的构建及其特性分析 被引量:1
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作者 卜昭阳 杨艳玲 +7 位作者 郎需龙 钱晶 李诗雨 李争 卢晓冉 沙洲 王莉 王兴龙 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第7期690-694,共5页
目的构建羊布鲁菌16M株的尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶(UTP-glucose-1-phosphate-uridylyltransferase,简称UGPase)基因缺失候选疫苗株,并对其侵染宿主巨噬细胞的能力及毒力进行初步分析。方法采用PCR技术对羊布鲁菌的UGP... 目的构建羊布鲁菌16M株的尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶(UTP-glucose-1-phosphate-uridylyltransferase,简称UGPase)基因缺失候选疫苗株,并对其侵染宿主巨噬细胞的能力及毒力进行初步分析。方法采用PCR技术对羊布鲁菌的UGPase基因上、下游同源臂进行克隆,利用基因同源重组技术构建自杀质粒,经两步筛选法对重组菌株筛选后,进行巨噬细胞黏附侵袭试验和小鼠体内毒力试验。结果自杀质粒p BK-CMV-Sac B-△UGP构建成功,经双向筛选获得了羊布鲁菌UGPase基因缺失株16M△UGP。16M△UGP缺失株侵入巨噬细胞的CFU数低于16M强毒株,但高于M5疫苗株;小鼠攻毒14 d后,其平均脾指数为(6.55±0.27)g,平均克脾菌数为1.64×104CFU/g,均低于16M强毒株。结论成功构建了羊布鲁菌16M株的UGPase基因缺失株,并证实了UGPase基因的缺失对16M株毒力具有一定影响。 展开更多
关键词 羊布鲁菌 UGPase基因缺失株 毒力
幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagQ基因缺失株的构建与鉴定 预览 被引量:1
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作者 姚逸正 王华 +4 位作者 倪颖 沈以新 徐驰 孙凤英 邵世和 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2014年第6期487-490,494共5页
目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)Ⅳ型分泌系统cag Q基因缺失株。方法:通过PCR扩增出cag Q基因编码区侧翼同源臂序列,经TA克隆后进行双酶切,并将纯化后上下游同源臂连接至两端含有卡那霉素抗生素基因的载体p Bluscrip... 目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)Ⅳ型分泌系统cag Q基因缺失株。方法:通过PCR扩增出cag Q基因编码区侧翼同源臂序列,经TA克隆后进行双酶切,并将纯化后上下游同源臂连接至两端含有卡那霉素抗生素基因的载体p Bluscript SK II(-),构建为cag Q基因自杀质粒。利用电穿孔法将自杀质粒导入H.pylori,进行同源重组。培养后通过卡那霉素抗生素筛选出基因缺失株,并经PCR及核酸序列分析进一步确定基因缺失株。结果:H.pylori的cag Q基因自杀质粒p Blue KM40-△cag Q经酶切验证无误,进行电转化后经PCR及核酸序列分析结果正确。结论:成功获得H.pylori cag Q基因缺失株,命名为Hp26695-△cag Q。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 Ⅳ型分泌系统 CAG Q 基因缺失株
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布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株的构建与鉴定 预览 被引量:6
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作者 王慧 张亚丽 +2 位作者 王远志 陈创夫 任晓丽 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2013年第1期30-34,共5页
为了构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,采用PCR方法分别从亲本株16 M上扩增omp31基因的侧翼看序列及枯草芽孢杆菌SacB基因,并将所得片段与pMD18-T载体相连并测序,利用双酶切的方法分别将其连入自杀载体pGEM-7zf+,获得亚克隆pGEM-7zf+... 为了构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,采用PCR方法分别从亲本株16 M上扩增omp31基因的侧翼看序列及枯草芽孢杆菌SacB基因,并将所得片段与pMD18-T载体相连并测序,利用双酶切的方法分别将其连入自杀载体pGEM-7zf+,获得亚克隆pGEM-7zf+-Δomp31-SacB。将所构建好的自杀载体通过电转化入布鲁氏菌16M感受态细胞中,经2次同源重组后筛选出16MΔomp31基因缺失株,并对获得缺失株进行遗传稳定性检测。结果显示:成功获得布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,该缺失株在15代内未发生回复性突变。本研究为今后研究布鲁氏菌抗凋亡机制奠定基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 omp31基因 缺失株
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Ⅰ型牛疱疹病毒TK-/gE-基因双缺失突变株生物学特性 预览
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作者 定明 范强 +5 位作者 时彦胜 张小飞 张广州 李春 白杰英 刘正飞 《中国比较医学杂志》 2012年第7期5-8,共4页
目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验... 目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验等技术方法,对重组基因所构成病毒突变株的生物学特性进行鉴定。结果 Southern杂交及蛋白斑点印迹表明,课题组成功构建了带有EGFP表达盒的双缺失突变株;该突变株具有与野生株相当的繁殖力,但TK-/gE-成功缺失,毒力大幅减弱;BHV-1 TK-/gE-遗传稳定,不会返强。结论本项目组成功构建了Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)的TK-/gE-双缺失突变株,该缺失株具有良好的安全性和稳定性,为该突变株进一步作为生物安全疫苗和多价病毒载体提供了依据,为预防和治疗牛传染性鼻气管炎提供了技术支持。 展开更多
关键词 牛疱疹病毒 TK-/gE-突变株 生物学特性
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