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RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和移植瘤生长的影响及其在小鼠结肠癌组织的表达 预览
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作者 王文娟 刘梦洁 +1 位作者 徐瑞 王淑红 《山西医科大学学报》 CAS 2019年第3期282-289,共8页
目的探讨Notch信号通路转录抑制因子RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响及其在小鼠模型结肠癌组织中的表达。方法用Western blot法和Real-time PCR法在8种结肠癌细胞中筛选出RBP-Jκ高表达的结肠癌细胞RKO及RBP-Jκ低表达... 目的探讨Notch信号通路转录抑制因子RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响及其在小鼠模型结肠癌组织中的表达。方法用Western blot法和Real-time PCR法在8种结肠癌细胞中筛选出RBP-Jκ高表达的结肠癌细胞RKO及RBP-Jκ低表达的结肠癌细胞SW480。用RBP-Jκ基因重组慢病毒载体上调SW480细胞中RBP-Jκ及靶向RBP-Jκ的shRNA慢病毒载体沉默RKO细胞中RBP-Jκ的表达,构建RBP-Jκ过表达的SW480细胞(SW480-RBP)及其对照细胞SW480-NC和RBP-Jκ沉默表达的RKO细胞(RKO-shRBP)及其对照细胞RKO-NC。MTT法检测SW480细胞和RKO细胞增殖能力的变化。构建转染细胞裸鼠皮下移植瘤模型,连续观察28 d,绘制移植瘤生长曲线,监测移植瘤生长情况;氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)诱导构建C57BL/6小鼠结肠癌模型,在结肠癌形成过程中每8周留取小鼠结肠组织,Western blot法和Real-time PCR法检测结肠组织中RBP-JκmRNA和蛋白表达的变化。结果MTT检测显示,SW480-RBP细胞的增殖速度较对照组SW480-NC细胞显著增快(P<0.05),RKO-shRBP细胞的增殖速度较对照组RKO-NC细胞显著降低(P<0.05)。裸鼠皮下移植瘤实验显示,SW480-RBP细胞所成肿瘤的体积、质量均高于对照组细胞(SW480-NC);RKO-shRBP细胞所成肿瘤的体积、质量均低于对照组细胞(RKO-NC)。在AOM诱导的C57BL/6小鼠结肠癌形成过程中,小鼠结肠组织中的RBP-JκmRNA和蛋白表达随着肿瘤形成逐渐升高。结论RBP-Jκ可以促进结肠癌细胞的增殖和裸鼠移植瘤生长,在AOM诱导的小鼠结肠癌中,RBP-Jκ蛋白表达增加与其发生发展相关。 展开更多
关键词 RBP-Jκ 移植瘤 结肠癌 慢病毒载体 基因沉默 细胞增殖
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小麦乙烯合成通路关键基因 TaACS2在抗赤霉病中的功能分析 预览
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作者 柯裴蓓 刘玉 +4 位作者 张婷 孙宇欣 何立强 肖进 王秀娥 《上海农业学报》 2019年第2期31-36,共6页
利用转录组学分析手段解析乙烯通路参与小麦抗赤霉病的调控网络,筛选到一个乙烯合成通路上的关键基因——氨基环丙烷羧酸合成酶基因TaACS2,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术在抗赤霉病小麦品种‘望水白’和‘苏麦3号’中沉默TaACS2基因,... 利用转录组学分析手段解析乙烯通路参与小麦抗赤霉病的调控网络,筛选到一个乙烯合成通路上的关键基因——氨基环丙烷羧酸合成酶基因TaACS2,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术在抗赤霉病小麦品种‘望水白’和‘苏麦3号’中沉默TaACS2基因,初步研究其在小麦抗赤霉病中的作用。结果表明:TaACS2基因在抗病品种‘苏麦3号’中受赤霉菌诱导上调表达,但在感病品种‘Alondras’中不受诱导,甚至下调表达。沉默TaACS2基因的植株接种赤霉菌后,与对照相比,‘苏麦3号’平均病小穗率从7.2%上升到13.3%,病穗轴率从4.6%上升到19.0%;‘望水白’平均病小穗率从10.8%上升到28.4%,病穗轴率从0上升到53.6%,两品种病小穗率和病穗轴率均显著提高,表明沉默TaACS2基因后,小麦赤霉病抗性显著下降,提示TaACS2基因正向参与调节小麦对赤霉病的抗病反应。 展开更多
关键词 赤霉病 乙烯通路 TaACS2基因 基因沉默
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Beclin-1基因沉默对蛇六谷提取物损伤胃癌SGC-7901细胞的影响
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作者 潘磊 胡梦奕 +2 位作者 李赛 陈培丰 尹利明 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期436-441,共6页
目的:探讨beclin-1基因沉默对蛇六谷提取物损伤人胃癌SGC-7901细胞的影响。方法:采用携带beclin-1-shRNA的慢病毒载体感染胃癌SGC-7901细胞,敲减beclin-1基因表达;蛇六谷提取物处理beclin-1基因敲减和未敲减的SGC-7901细胞,CCK-8法检测... 目的:探讨beclin-1基因沉默对蛇六谷提取物损伤人胃癌SGC-7901细胞的影响。方法:采用携带beclin-1-shRNA的慢病毒载体感染胃癌SGC-7901细胞,敲减beclin-1基因表达;蛇六谷提取物处理beclin-1基因敲减和未敲减的SGC-7901细胞,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡率,Western blot检测beclin-1和LC3的蛋白表达水平。结果:Beclin-1-shRNA转染SGC-7901细胞抑制beclin-1的mRNA和蛋白表达,促进LC3蛋白表达,降低细胞活力,增加细胞凋亡率(P<0.05);蛇六谷提取物上调SGC-7901细胞的beclin-1和LC3蛋白表达,但下调beclin-1基因敲减的SGC-7901细胞的LC3蛋白表达,并显著降低细胞活力和增加细胞凋亡率(P<0.05)。结论:Beclin-1基因沉默阻断蛇六谷提取物对beclin-1相关信号通路的激活,增强蛇六谷提取物对胃癌SGC-7901细胞活力的损伤作用。 展开更多
关键词 蛇六谷 胃癌 BECLIN-1 基因沉默 细胞活力
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小干扰RNA通过沉默Rhc糖蛋白调节血氨研究 预览
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作者 孙晨 赵骥越 卢再鸣 《创伤与急危重病医学》 2019年第1期16-19,共4页
目的观察小干扰RNA通过沉默Rhc糖蛋白调节血氨的效果,为肝性脑病的靶向药物治疗提供依据。方法培养原代小鼠脑微血管内皮细胞,用阳离子脂质体将小干扰RNA序列Rhcg-Mus-455、Rhcg-Mus-607、Rhcg-Mus-883转染进小鼠脑微血管内皮细胞中,提... 目的观察小干扰RNA通过沉默Rhc糖蛋白调节血氨的效果,为肝性脑病的靶向药物治疗提供依据。方法培养原代小鼠脑微血管内皮细胞,用阳离子脂质体将小干扰RNA序列Rhcg-Mus-455、Rhcg-Mus-607、Rhcg-Mus-883转染进小鼠脑微血管内皮细胞中,提取并转染细胞蛋白与RNA,行蛋白质免疫印迹实验与琼脂糖凝胶电泳实验,观察细胞内氨转运蛋白及其mRNA的表达情况,以此观察小干扰RNA对细胞Rhcg基因的沉默效果与沉默效率,筛选出能够高效抑制小鼠脑微血管内皮细胞中氨转运体基因的小干扰RNA序列。结果蛋白质免疫印迹实验中,3个小干扰RNA序列Rhcg-Mus-455、Rhcg-Mus-607、Rhcg-Mus-883的Rhcg蛋白水平两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);但Rhcg-Mus-455、Rhcg-Mus-607、Rhcg-Mus-883的Rhcg蛋白水平均低于生理盐水与阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。琼脂糖凝胶电泳实验中,3个小干扰RNA序列Rhcg-Mus-455、Rhcg-Mus-607、Rhcg-Mus-883的RhcgmRNA水平两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);但Rhcg-Mus-455的RhcgmRNA水平低于生理盐水与阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论3个小干扰RNA序列对小鼠脑微血管内皮细胞中的氨转运体均有沉默表达作用,其中,小干扰RNA序列Rhcg-Mus-455具有更高的沉默效率。因此,通过基因沉默技术,在体外找到能够特异性结合氨转运蛋白的小干扰RNA,可抑制血氨转运,进而改善肝性脑病。 展开更多
关键词 肝性脑病 氨转运体 Rhcg 小干扰RNA 基因沉默
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Fibulin-3表达对恶性胸膜间皮瘤细胞的影响
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作者 莫世贤 邓勇军 +4 位作者 刘焕鹏 李珏 陈理军 赵金燕 张良 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期448-453,共6页
目的:研究纤蛋白3(fibulin-3)基因过表达/沉默对人恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)细胞系SMC-1的影响,为MPM的治疗寻找新的方法。方法:分别构建fibulin-3过表达和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体,并将SMC-... 目的:研究纤蛋白3(fibulin-3)基因过表达/沉默对人恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)细胞系SMC-1的影响,为MPM的治疗寻找新的方法。方法:分别构建fibulin-3过表达和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体,并将SMC-1细胞分别转染空白对照载体(control)、过表达载体(Exp)、过表达对照载体(Exp-NC)、干扰载体(shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4)和干扰对照载体(shRNA-NC)。应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡,real-time PCR法和Western blot法检测过表达/干扰前后fibulin-3的表达情况。结果:SMC-1细胞转染相应载体后,流式细胞术结果显示,与control组相比,fibulin-3+Exp组的G2期细胞数量增加(P<0.05),shRNA2组的G2期数量减少(P<0.05);凋亡检测结果显示,与control组相比,Exp组的细胞凋亡率下降(P<0.05),而shRNA2组的细胞凋亡率上升(P<0.05)。分子水平检测结果显示,与control组相比,Exp组fibulin-3和间皮素(mesothelin)的mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.05),各shRNA组fibulin-3和mesothelin的mRNA和蛋白表达水平下调(P<0.05)。结论:本实验构建了fibulin-3基因的过表达及沉默载体,证实转染Exp和shRNA能有效改变fibulin-3的表达水平及SMC-1细胞的生长,为以fibulin-3为靶点的RNA沉默手段应用于临床MPM的治疗提供了实验依据。 展开更多
关键词 恶性胸膜间皮瘤 短发夹RNA 纤蛋白3 间皮素 基因沉默
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蛋白酶体激活因子γ对未分化甲状腺癌细胞摄碘功能的影响
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作者 亓龙 何薇 《中华核医学与分子影像杂志》 CAS 北大核心 2019年第2期100-103,共4页
目的 观察沉默蛋白酶体激活因子γ(REGγ)前后的甲状腺癌ARO及WRO细胞株的摄碘能力变化及摄碘相关特异蛋白mRNA水平变化,研究REGγ与甲状腺癌摄碘的关系。 方法 常规培养AROshN、AROshR、WROshN及WROshR甲状腺癌细胞株(shN为空白质粒,sh... 目的 观察沉默蛋白酶体激活因子γ(REGγ)前后的甲状腺癌ARO及WRO细胞株的摄碘能力变化及摄碘相关特异蛋白mRNA水平变化,研究REGγ与甲状腺癌摄碘的关系。 方法 常规培养AROshN、AROshR、WROshN及WROshR甲状腺癌细胞株(shN为空白质粒,shR为沉默REGγ质粒),加入低剂量Na125I(3.7 kBq)后5、10、15、20、40和70 min测量细胞的摄碘率,观察细胞摄碘能力的变化,并利用实时荧光PCR检测摄碘相关特异蛋白[钠/碘转运体(NIS)、促甲状腺激素受体(TSHR)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(Tg)]mRNA水平的变化。采用配对t检验分析数据。 结果 沉默REGγ的AROshR及WROshR细胞摄碘能力均提高,其中AROshR细胞的提高率为128.1%[峰值(1 974±12)与(4 502±23)计数/min;t=17.30,P<0.05],WROshR细胞的提高率为67.4%[峰值(2 988±25)与(5 001±16)计数/min,t=13.20,P<0.05]。沉默REGγ的AROshR及WROshR细胞的NIS、TSHR、TPO、Tg mRNA表达均提高,其中在AROshR细胞中分别为AROshN细胞中的2.82、1.98、2.65和2.31倍,在WROshR细胞中分别为WROshN细胞中的2.21、1.78、2.51和1.78倍,与未沉默组相比差异均有统计学意义(t值:13.80~21.93,均P<0.05)。 结论 沉默REGγ可使甲状腺癌细胞摄碘相关特异蛋白上调表达,从而提高未分化型甲状腺癌细胞的摄碘能力。 展开更多
关键词 甲状腺肿瘤 肿瘤细胞 培养的 蛋白酶体内肽酶复合物 基因沉默 碘放射性同位素
沉默氧增强蛋白(OEE2)对辣椒疫霉效应因子RxLR19781的免疫功能影响 预览
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作者 梁涛 王俪颖 +3 位作者 朱彤彤 马艳飞 江韦霖 冀瑞卿 《山东农业大学学报:自然科学版》 北大核心 2019年第1期40-43,共4页
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种寄生范围广且能够产生大量RxLR效应因子来参与侵染寄主的病原卵菌。资料表明目前对多数辣椒疫霉RxLR效应因子在植物体内如何行使功能积累较少。本研究从辣椒疫霉菌中分离鉴定1个效应分子RxLR197... 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种寄生范围广且能够产生大量RxLR效应因子来参与侵染寄主的病原卵菌。资料表明目前对多数辣椒疫霉RxLR效应因子在植物体内如何行使功能积累较少。本研究从辣椒疫霉菌中分离鉴定1个效应分子RxLR19781,为了初步明确RxLR19781的功能特性,本研究借助于烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)介导的基因沉默技术,将RxLR19781的互作蛋白基因NbOEE2在本氏烟中瞬时沉默,通过qRT-PCR验证得到NbOEE2沉默植株,在沉默后的本氏烟植株中接种RxLR19781并验证该RxLR效应因子的功能。结果表明,在NbOEE2沉默植株上,RxLR19781不抑制辣椒疫霉游动孢子侵染。本研究结果表明OEE2可有效调控RxLR19781的功能特性,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR19781功能机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 辣椒疫霉 效应因子 TRV 基因沉默
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沉默Wnt4基因抑制大鼠肾间质纤维化 预览
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作者 杨阳 白海涛 +1 位作者 李玲 陈美雪 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期215-221,共7页
目的探讨沉默 Wnt 4基因对肾间质纤维化的影响,为慢性肾病的治疗提供理论依据。方法 128 只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阴性对照组和 Wnt 4基因沉默组,每组32 只。构建 Wnt 4 siRNA 慢病毒载体体内转染沉默组的大鼠,于转染后第3、... 目的探讨沉默 Wnt 4基因对肾间质纤维化的影响,为慢性肾病的治疗提供理论依据。方法 128 只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阴性对照组和 Wnt 4基因沉默组,每组32 只。构建 Wnt 4 siRNA 慢病毒载体体内转染沉默组的大鼠,于转染后第3、7、10、14天分为四个亚组,每组8只大鼠。通过H&E染色病理检查、RT-PCR技术检测肾间质改变及β-连环蛋白、 Wnt 4、α-SMA表达情况。结果 H&E染色病理检查结果表明:假手术组四个时间点未见肾间质改变;UUO组、阴性沉默组及沉默组造模后3 d出现肾间质水肿、少量肾间质纤维化,10、14 d肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润,呈加重趋势;阴性沉默组基因与UUO组相同;沉默组四个时间点均出现不同程度肾间质纤维化,14 d肾间质纤维化程度低于阴性沉默组及UUO组( P < 0.05);Wnt 4基因沉默后UUO组 mRNA表达量的相关性分析显示, Wnt 4与β-catenin mRNA表达量具有显著相关性( r =0.886, P < 0.001)。 Wnt 4与α-SMA mRNA表达量具有显著相关性( r =0.930, P < 0.001)。 Wnt 4基因沉默后沉默组mRNA表达量的相关性分析显示, Wnt 4与β-catenin mRNA表达量无显著相关性( r =0.204, P =0.263)。 Wnt 4与α-SMA mRNA表达量具有显著相关性( r =0.753, P < 0.001)。结论沉默 Wnt 4基因在肾间质纤维化大鼠中可明显抑制肾间质纤维化,可能对其有治疗作用。 展开更多
关键词 Wnt4基因 基因沉默 肾间质纤维化 大鼠
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转化生长因子β1基因沉默内皮祖细胞移植抑制大鼠肺纤维化 预览
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作者 彭秋凤 高静珍 +1 位作者 叶奎 邢爱民 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第1期90-95,共6页
背景:大量动物实验证明转化生长因子β1基因是目前肺纤维化的研究热点和重要的药物作用靶点。目的:探讨转化生长因子β1基因沉默内皮祖细胞移植对大鼠肺纤维化的影响。方法:①构建靶向转化生长因子β1的siRNA质粒,转染内皮祖细胞,分为... 背景:大量动物实验证明转化生长因子β1基因是目前肺纤维化的研究热点和重要的药物作用靶点。目的:探讨转化生长因子β1基因沉默内皮祖细胞移植对大鼠肺纤维化的影响。方法:①构建靶向转化生长因子β1的siRNA质粒,转染内皮祖细胞,分为空白组、对照组及转化生长因子β1基因沉默组,Western blot检测转染第3天和第28天转化生长因子β1表达;②80只Wistar大鼠(北京维通利华动物实验技术有限公司提供)分为正常对照组、肺纤维化模型组、内皮祖细胞组、转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组,后3组大鼠气管内分别一次性注入0.3 mL博莱霉素溶液(5 mg/kg)以制备大鼠肺纤维化病理模型,造模后24 h,正常对照组和肺纤维化模型组大鼠尾静脉注射20μL生理盐水,内皮祖细胞组及转化生长因子β1沉默组大鼠尾静脉注射20μL细胞浓度为3×106 L-1的内皮祖细胞悬液或转化生长因子β1沉默内皮祖细胞悬液;③移植28 d后,ELISA测定大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞介素10、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子α水平,苏木精-伊红染色观察肺组织病理变化,RT-PCR、Western blot检测肺组织中转化生长因子β1及Smad-2、Smad-7的表达。结果与结论:①在转染后第3天和第28天,转化生长因子β1基因沉默组的转化生长因子β1蛋白相对表达水平低于空白组和对照组,差异有显著性意义(P<0.05);②内皮祖细胞组较肺纤维化模型组病理变化减轻,肺泡间隔厚度低,转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组病理变化进一步减轻;③内皮祖细胞组白细胞介素10、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子α水平较肺纤维化模型组降低(P<0.05),转化生长因子β1沉默内皮祖细胞组进一步降低,但与内皮祖细胞组比较,差异无显著性意义(P>0.05);④与肺纤维化模型组相比,内皮祖细胞组和转化生长因子β1沉默组大鼠肺组织中转化生长因子β1和Smad-2的基因和蛋� 展开更多
关键词 肺纤维化 内皮祖细胞 转化生长因子Β1 基因沉默 Smad-2 Smad-7 干细胞 肺纤维化 内皮细胞 基因沉默 转化生长因子Β1 Smad2蛋白质 Smad7蛋白质 组织工程
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组织蛋白酶B通过瞬时受体电位黏蛋白- 1对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体活化的影响
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作者 段娟娟 张启芳 +2 位作者 黄宗华 曾红梅 柏华 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期208-215,共8页
目的探索在细胞氧化应激模型和特异性基因沉默细胞模型中,组织蛋白酶B(CTSB)通过瞬时受体电位黏蛋白-1(TRPML1)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法对体外培养的BV2细胞分别用H2O2、钙敏感性受体激动剂... 目的探索在细胞氧化应激模型和特异性基因沉默细胞模型中,组织蛋白酶B(CTSB)通过瞬时受体电位黏蛋白-1(TRPML1)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法对体外培养的BV2细胞分别用H2O2、钙敏感性受体激动剂GdCl3、CTSB抑制剂CA-074Me单独或同时处理,用酶联免疫吸附实验方法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和半胱天冬酶-1-蛋白;用定量PCR方法检测各组BV2细胞的NLRP3mRNA。用MTT法检测各组BV2细胞生长活力。用定量PCR方法检测BV2细胞中胱抑素C和TRPML1的mRNA,用Westernblot检测TRPML1、CTSB、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶V(CTSV)蛋白。针对TRPML1基因靶序列设计特异性小干扰RNA(siRNA),在BV2细胞中建立TRPML1基因沉默细胞株(命名为Tr-si-BV2细胞),通过H2O2处理,再用Westernblot检测Tr-si-BV2细胞或对照组细胞中的TRPML1、CTSB和转录因子EB(TFEB)蛋白。结果用H2O2处理后,BV2细胞中半胱天冬酶-1蛋白和NLRP3mRNA表达增加,加用GdCl3处理后,BV2细胞中IL-1β显著增加(P=0.0036);使用CA-074Me处理后,NLRP3mRNA(P=0.037)、半胱天冬酶-1(P=0.021)、IL-1β(P=0.036)均显著减少。H2O2组和H2O2+GdCl3组的细胞生长较慢。在H2O2浓度为200μmol/L的处理组,BV2细胞中CTSBmRNA与TRPML1mRNA、或CTSB与TRPML1蛋白的表达均有相似的变化;沉默TRPML1基因表达水平后能够抑制H2O2诱导的CTSB蛋白表达。组织蛋白酶CTSD、CTSL、CTSV的变化不受H2O2处理浓度高低的影响。在进行TRPML1基因沉默处理的BV2细胞中,H2O2+siRNA处理组与H2O2处理组比较,CTSB蛋白的表达显著减少(P=0.021)。结论在小胶质细胞的氧化应激模型中,CTSB具有调节NLRP3炎症小体活化的作用,这种作用有可能通过钙离子通道蛋白TRPML1介导。 展开更多
关键词 过氧化氢 组织蛋白酶B 炎症小体 基因沉默 瞬时受体电位黏蛋白-1
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3β-HSD基因沉默细胞株的建立及其对DEHP致凋亡的影响
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作者 王利 秦逍云 +4 位作者 徐新云 曾怀才 郑凯 王冰玉 龙鼎新 《中华劳动卫生职业病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期13-19,共7页
目的构建3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因shRNA慢病毒干扰载体,建立3β-HSD基因沉默细胞株,研究3β-HSD基因沉默对塑化剂邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)致凋亡的影响。方法根据GenBank提供的3β-HSD基因mRNA序列,设计合成3条干扰序列... 目的构建3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因shRNA慢病毒干扰载体,建立3β-HSD基因沉默细胞株,研究3β-HSD基因沉默对塑化剂邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)致凋亡的影响。方法根据GenBank提供的3β-HSD基因mRNA序列,设计合成3条干扰序列,退火后连接到PLVX-shRNA2-puro中,将重组慢病毒载体转染293FT细胞,收集病毒上清,感染MCF-7细胞。利用嘌呤霉素筛选得到3β-HSD沉默细胞株,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Westernblot)对干扰效果进行鉴定。用不同剂量DEHP对MCF-7细胞和3β-HSD沉默细胞染毒24h,检测凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的基因和蛋白表达水平的变化。结果该实验插入慢病毒载体PLVX-shRNA2-puro中的3β-HSD基因干扰序列与设计的序列一致;3β-HSD沉默细胞中3β-HSD基因表达水平较对照组MCF-7细胞降低77%,3β-HSD蛋白表达水平较对照组MCF-7细胞降低74%。不同剂量DEHP染毒3β-HSD沉默细胞和MCF-7细胞后,qRT-PCR结果显示,MCF-7细胞中Bax基因表达水平较对照组(0mmol/LDEHP)升高28%~54%,Caspase-3基因表达水平升高13%~49%,Caspase-8基因表达升高21%~70%。与同染毒剂量组的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞中Bax基因表达水平降低11%~28%,Caspase-3基因表达降低12%~23%,Caspase-8基因表达降低11%~34%。Westernblot结果显示,MCF-7细胞中BAX蛋白表达水平较对照组升高28%~61%,Caspase-3蛋白表达升高40%~48%,Caspase-8蛋白表达升高31%~84%。与同染毒剂量组的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞Bax蛋白表达水平降低11%~27%,Caspase-3蛋白表达降低21%~40%,Caspase-8蛋白表达降低12%~25%。结论该研究成功构建了3β-HSD基因沉默细胞株。DEHP可引起细胞凋亡基因及蛋白表达升高,3β-HSD基因沉默能在一定程度上抑制DEHP对凋亡基因的活化。 展开更多
关键词 3β-羟类固醇脱氢酶 基因沉默 邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯 细胞凋亡
沉默SETD8基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用 预览
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作者 张津 丁界先 +3 位作者 安江东 王景 王兴文 王栓科 《临床和实验医学杂志》 2019年第5期449-454,共6页
目的 探究siRNA下调含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶) 8(SETD8)基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的机制。方法 采用脂质体法将特异性针对SETD8基因的siRNA转入骨肉瘤MG-63细胞中,得到关于SETD8基因沉默表达的MG-6... 目的 探究siRNA下调含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶) 8(SETD8)基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的机制。方法 采用脂质体法将特异性针对SETD8基因的siRNA转入骨肉瘤MG-63细胞中,得到关于SETD8基因沉默表达的MG-63稳定的细胞系即实验组,将杂序siRNA用脂质体法同时转染骨肉瘤MG-63细胞,得到关于Control siRNA的MG-63细胞系即对照组,未经转染的骨肉瘤MG-63的稳定的细胞系即空白组。以上三组细胞系通过应用细胞毒性活性检测法(CCK-8法)、平板克隆法同时检测被SETD8基因沉默后骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力,侵袭迁移小室即(Transwell小室)法检测骨肉瘤MG-63细胞的侵袭和迁移能力,实时荧光定量法即(PCR法)以及蛋白质印迹法即(Western Blot法)检测SETD8基因沉默表达效果及细胞内SETD8,β-catenin,cyclin D1,vimentin、MMP3的mRNA和相应蛋白的表达水平。结果 SETD8 siRNA转染后,骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力显著低于对照组(control siRNA转染MG-63细胞)和空白组(未经转染的MG-63细胞)(P <0. 05);Transwell小室结果显示,沉默SETD8基因组的侵袭和迁移能力明显下降;实验组(SETD8 siRNA转染MG-63细胞)中SETD8、β-catenin、cyclin D1、vimentin、MMP3的mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组(P <0. 05)。结论 siRNA下调SETD8基因表达可以抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖、侵袭和迁移能力,Wnt/β-catenin信号通路可能参与并调控这一过程。 展开更多
关键词 骨肉瘤 SETD8 基因沉默 细胞增殖 侵袭迁移 小分子干扰
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基质金属蛋白酶9对星形胶质细胞缺氧缺糖后水通道蛋白4表达的影响及调节机制
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作者 李燕华 韦俊杰 +3 位作者 范秉林 陈志 韦旋 李吕力 《中华行为医学与脑科学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期110-115,共6页
目的探讨基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)沉默对星形胶质细胞缺氧缺糖后水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)表达的影响及其调节机制。方法取出生后2 d的SD大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯化培养,通过缺氧缺糖处理建立缺血... 目的探讨基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)沉默对星形胶质细胞缺氧缺糖后水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)表达的影响及其调节机制。方法取出生后2 d的SD大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯化培养,通过缺氧缺糖处理建立缺血细胞模型,实验分为正常组、阴性对照组和MMP-9沉默组。比色法测定细胞和上清液的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,利用慢病毒转染沉默MMP-9,并通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot法分别检测星形胶质细胞AQP4和MMP-9的表达变化,Western blot法检测细胞PKA、PKC、PKG、CaMKⅡ蛋白含量。结果细胞经缺氧缺糖处理后,LDH漏出率与正常组相比明显增高(t=13.35,P<0.01);MMP-9沉默组星形胶质细胞MMP-9 mRNA(0.412±0.297)表达较阴性对照组(1.118±0.240)显著下调(t=-4.964,P<0.05);伴随MMP-9表达的降低,MMP-9沉默组AQP4 mRNA(1.002±0.082)较阴性对照组(1.442±0.066 )明显下调(t=-9.886,P<0.01);MMP-9沉默组AQP4蛋白(0.643±0.036)较阴性对照组(1.000±0.069)也明显下调(t=-11.073,P<0.01);MMP-9沉默组的星形胶质细胞PKC蛋白表达(0.198±0.110)较阴性对照组(0.980±0.232)明显减低(t=-7.218,P<0.01),但蛋白激酶PKA、PKG、CaMKⅡ表达均差异无统计学意义(t分别为0.875、0.818、0.933,均P>0.05)。结论缺氧缺糖导致星形胶质细胞通透性增高,基因MMP-9沉默后可介导AQP4表达下调,MMP-9可能是通过调控PKC的活性来调节AQP4的表达。 展开更多
关键词 基因沉默 基质金属蛋白酶9 水通道蛋白4 星形胶质细胞 缺氧缺糖
富含亮氨酸重复蛋白8A膜蛋白对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响 预览
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作者 李红 黎星 +2 位作者 霍聪 夏跃胜 王晓明 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2019年第3期299-303,共5页
目的探讨干扰富含亮氨酸重复蛋白8A(LRRC8A)膜蛋白对心肌缺血再灌注(IR)损伤心脏功能的影响及可能机制。方法选择SPF级健康雄性SD大鼠48只随机分为假手术组、模型组、基因沉默(LRRC8A-siRNA)组和空载体(Scrambled-siRNA)组,每组12只。... 目的探讨干扰富含亮氨酸重复蛋白8A(LRRC8A)膜蛋白对心肌缺血再灌注(IR)损伤心脏功能的影响及可能机制。方法选择SPF级健康雄性SD大鼠48只随机分为假手术组、模型组、基因沉默(LRRC8A-siRNA)组和空载体(Scrambled-siRNA)组,每组12只。模型组、基因沉默组和空载体组建立心肌IR损伤大鼠模型;假手术组不进行结扎。假手术组和模型组于术前24h注射PBS,基因沉默组和空载体组则分别注射LRRC8A-siRNA、Scrambled-siRNA混合液;再灌注2h后检测左心室舒张期末内径(LVEDD)、左心室收缩期末内径(LVESD)、LVEF和左心室短轴缩短率(LVFS)及心肌活性氧、自噬相关蛋白LC3Ⅱ、溶酶体相关蛋白(LAMP2)、ATP、血清NF-κB、TNF-α和白细胞介素6(IL-6)、肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;观察心肌组织病理形态学变化;免疫组织化学法检测心肌LC3Ⅱ和LAMP2表达。结果模型组LVEDD、LVESD、血清CK、CK-MB、LDH、活性氧、NF-κB、TNF-α、IL-6水平及LC3Ⅱ表达明显高于假手术组,而LVEF、LVFS、ATP水平及LAMP2表达明显低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,基因沉默组LVEDD、LVESD、血清CK、CK-MB、LDH、活性氧、NF-κB、TNF-α和IL-6水平及LC3Ⅱ表达明显降低(P<0.01),而LVEF[(0.65±0.04)%vs (0.42±0.08)%]、LVFS[(48.91±3.01)%vs (28.63±8.17)%]、ATP水平[(11.1±0.2)ng/g vs(0.9±0.1)ng/g]及LAMP2表达(5.23±0.50 vs 0.41±0.03)明显升高(P<0.01);空载体组各指标与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。光学显微镜下可见,基因沉默组心肌细胞形态基本正常,较少发生炎性细胞浸润。结论干扰LRRC8A膜蛋白能够通过抑制活性氧过量产生、炎症及过度自噬,保护心肌线粒体功能,达到预防心肌IR损伤及保护心脏功能的作用。 展开更多
关键词 亮氨酸 膜蛋白质类 心肌缺血 再灌注损伤 基因沉默
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补肾活血汤通过Runx2/Osterix促进骨质疏松模型大鼠的骨折愈合 预览
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作者 胡流超 罗毅文 +3 位作者 程英雄 吴志方 罗辉 沈玮 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第11期1717-1722,共6页
背景:Runx2/Osterix是促进成骨细胞分化的重要的转录因子,研究发现中药能通过上调Runx2/Osterix促进骨折愈合。补肾活血汤是临床上治疗骨折的经验方药,能促进骨形成,通过探究其作用机制更好服务临床。目的:通过慢病毒载体介导Runx2基因... 背景:Runx2/Osterix是促进成骨细胞分化的重要的转录因子,研究发现中药能通过上调Runx2/Osterix促进骨折愈合。补肾活血汤是临床上治疗骨折的经验方药,能促进骨形成,通过探究其作用机制更好服务临床。目的:通过慢病毒载体介导Runx2基因沉默,研究补肾活血汤对骨质疏松模型大鼠骨折愈合影响及分子机制。方法:将广州中医院药大学动物实验中心提供的40只4月龄成年雌性SD大鼠随机等为5组,模型组、补肾活血汤组、Runx2沉默组、Runx2沉默+补肾活血汤组及对照组,对照组只建立股骨骨折模型,其他各组切除双侧卵巢并造成股骨骨折制作骨质疏松骨折大鼠模型。建模后补肾活血汤组、Runx2沉默+补肾活血汤组予以补肾活血汤灌胃,模型组、对照组及Runx2沉默组予以等体积蒸馏水灌胃;Runx2沉默组、Runx2沉默+补肾活血汤组于骨折处注射Runx2重组慢病毒,模型组、对照组及补肾活血汤组于相同部位处注射等体积PBS。建模4周后,Micro CT测定股骨标本骨密度、组织矿物质密度及骨体积分数(BV/TV),qPCR、Western blot测定骨痂成骨标志基因Runx2及Osterix mRNA及蛋白的表达水平。结果与结论:①与对照组相比,模型组骨密度、组织矿物质密度、Runx2和Osterix mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.01);②与模型组相比,补肾活血汤组骨体积分数(BV/TV)、Runx2、Osterix mRNA表达量升高(P<0.05),而骨密度、组织矿物质密度、Runx2及Osterix蛋白表达量显著升高(P<0.01);Runx2沉默组骨体积分数和Osterix mRNA表达量降低(P<0.05),骨密度、组织矿物质密度、Runx2 mRNA及蛋白表达量、Osterix蛋白表达量显著降低(P<0.01);③与Runx2沉默组比较,Runx2沉默+补肾活血汤组上述全部指标的mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.01);④结果表明,慢病毒介导Runx2基因沉默使大鼠骨质疏松骨折愈合延缓,补肾活血汤能上调Runx2/Osterix表达,逆转Runx2基因沉默的效� 展开更多
关键词 补肾活血汤 骨质疏松 骨质疏松性骨折 骨质疏松性骨折愈合 慢病毒 核心结合因子 骨形成 组织工程 基因沉默 骨折愈合
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沉默SCAP基因对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响
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作者 邢智洋 张梦璐 +4 位作者 张菡 王月影 韩立强 高腾云 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期507-516,共10页
旨在探究沉默固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响,本研究构建了SCAP短发夹RNA慢病毒载体,包装感染奶牛乳腺上皮细胞,通过在培养基中添加嘌呤霉素筛选获得 SCAP 基... 旨在探究沉默固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响,本研究构建了SCAP短发夹RNA慢病毒载体,包装感染奶牛乳腺上皮细胞,通过在培养基中添加嘌呤霉素筛选获得 SCAP 基因沉默稳转细胞株,采用Real-time PCR和Western blot观察基因沉默细胞株中SCAP基因和蛋白的表达,尼罗河红和油红O染色脂滴检测 SCAP 基因沉默及SCAP质粒瞬时转染对细胞脂滴形成的影响。结果表明,本研究成功构建了奶牛 SCAP 基因沉默慢病毒重组载体,感染细胞后经过5 mg·L -1 嘌呤霉素筛选得到 SCAP 基因沉默稳转细胞株。基因检测发现,各个沉默细胞株的 SCAP 基因表达显著降低( P <0.05 或 P <0.01)。与对照组相比,RNAi-SCAP3细胞中的SCAP蛋白表达降低为对照组的0.49倍( P <0.05),脂代谢基因 SCD 和 FAS 表达也显著下降( P <0.05)。脂滴染色发现,RNAi-SCAP3沉默细胞株的脂滴含量显著低于对照组细胞( P <0.01),脂滴直径≤2.0 μm的小脂滴个数增多,而直径≥2.5 μm的大脂滴个数减少;将SCAP真核表达载体瞬时转染RNAi-SCAP3细胞株后发现, SCAP 基因的过表达显著减少了细胞中小脂滴比例而增加了大脂滴比例( P <0.05)。本研究成功构建了 SCAP 基因沉默稳转细胞株,发现SCAP的表达影响了细胞脂滴直径的大小。 展开更多
关键词 奶牛 奶牛乳腺上皮细胞 固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白 基因沉默 脂滴
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TRPV6对结肠癌SW480细胞生物学行为及小鼠模型中结肠肿瘤发生的影响
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作者 谢臣武 刘模荣 +4 位作者 董辉 徐靖宇 谢睿 文国荣 刘莲花 《中国肿瘤临床》 CSCD 北大核心 2018年第21期1079-1085,共7页
目的:通过观察沉默瞬时受体阳离子通道亚家族V成员6(transient receptor potential cation channel,subfamily V member 6,TRPV6)对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响和细胞内钙的浓度变化,以及1,25(OH)2D3、CaCl2及CuCl2在SD大鼠... 目的:通过观察沉默瞬时受体阳离子通道亚家族V成员6(transient receptor potential cation channel,subfamily V member 6,TRPV6)对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响和细胞内钙的浓度变化,以及1,25(OH)2D3、CaCl2及CuCl2在SD大鼠结肠肿瘤模型建立中的影响,探索TRPV6在结肠癌发生过程中的相关作用,为结肠癌的防治寻找新的靶点。方法:通过构建慢病毒颗粒感染结肠癌SW480细胞,采用免疫组织化学法、Western bolt、PCR技术检测TRPV6蛋白及m RNA的表达,MTT法、迁移及凋亡实验观察结肠癌SW480细胞增殖、迁移及凋亡变化,高速离子成像系统测定结肠癌SW480细胞内的Ca2+浓度变化。以二甲基肼(dimethyl hydrazine,DMH)建立SD大鼠结肠肿瘤模型,分为实验组(DMH组)和干预组[(DMH+1,25(OH)2D3组、DMH+CuCl2组)]、对照组,干预组分别予1,25(OH)2D3(37.5 nmol/kg)、CuCl2(375μmol/kg)对模型进行干预。观察各组大鼠结肠腺瘤及腺癌的发生情况,Western blot检测各组结肠组织中TRPV6蛋白的表达情况。结果:TRPV6-RNAi转染结肠癌SW480细胞后,TRPV6 m RNA及蛋白表达减少,细胞Ca2+浓度水平降低,结肠癌SW480细胞的增殖率、迁移能力下降,细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性对照组比较差异具有统计学意义(P〈0.05)。对照组大鼠成瘤率为0,DMH+1,25(OH)2D3组为100%,DMH组为84.62%,DMH+CuCl2组为33.33%。各组大鼠大肠中均有TRPV6蛋白的表达,表达情况为DMH+1,25(OH)2D3组〉DMH组〉DMH+CuCl2组〉对照组,差异具有统计学意义(P〈0.05)。结论:降低结肠癌SW480细胞Ca2+浓度水平可抑制结肠癌SW480细胞的增殖、迁移能力,诱导细胞凋亡。1,25(OH)2D3可以增加实验鼠结肠组织TRPV6蛋白表达,促进结肠肿瘤的形成。CuCl2可以使实验鼠结肠组织中的TRPV6蛋白表达降低,并抑制结肠肿瘤的形成。 展开更多
关键词 TRPV6 基因沉默 钙离子通道 结肠癌 二甲基肼
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芒果多胺氧化酶2(MiPAO2)基因克隆表达分析与沉默和过量表达载体的构建
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作者 刘宽亮 赵志常 +4 位作者 高爱平 黄建峰 党志国 罗睿雄 陈业渊 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2018年第14期4638-4647,共10页
本研究以芒果果皮为材料探究多胺(PAs)和多胺氧化酶2(PAO2)对芒果果实抗逆性的作用机理。多胺(PAs)如腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)是无处不在的聚阳离子,在不同的细胞代谢过程具有广泛的功能。多胺氧化酶2(polyamine... 本研究以芒果果皮为材料探究多胺(PAs)和多胺氧化酶2(PAO2)对芒果果实抗逆性的作用机理。多胺(PAs)如腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)是无处不在的聚阳离子,在不同的细胞代谢过程具有广泛的功能。多胺氧化酶2(polyamine oxidase 2,PAO2)是真核生物多胺分解代谢途径中的关键酶。本研究根据转录组测序得到芒果PAO2部分片段信息设计兼并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色芒果品种(红色‘贵妃’品种,黄色‘金煌’品种,绿色‘桂七’品种)中进行PAO2基因全长cDNA序列的扩增,克隆得到了芒果果皮PAO2基因的全长cDNA序列命名为MiPAO2。结果发现三个着色品种cDNA序列只有几个碱基的差异,以红色‘贵妃’品种为例分析可得全长cDNA序列为1 542 bp,开放阅读框为1 209 bp,编码402个氨基酸,分子重量为43.93 kD,等电点为5.60,定位于过氧化物酶体。通过生物软件预测得到了三种三级蛋白结构图。对NCBI上刊载的30种不同植物构建系统发育树发现该基因编码的蛋白与枳的亲缘关系比其他植物物种的亲缘关系近。为深入探究MiPAO2基因在多胺分解代谢过程中的作用,本研究成功构建出MiPAO2-pTRV2基因沉默载体和MiPAO2-pGreen II 62-SK基因过量表达载体,为后续研究MiPAO2基因在芒果果实的抗盐、抗寒以及抗虫过程中的作用机理提供理论依据。 展开更多
关键词 芒果 基因克隆 多胺氧化酶2 基因沉默 过量表达
基于RNAi的转基因作物研发进展 预览
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作者 张守路 饶力群 汪启明 《现代农业科技》 2018年第21期3-4,6共3页
转基因技术作为现代生物技术的重要组成部分,在缓解资源匮乏、提高粮食产量、保护生态环境安全、拓展农业功能等方面做出巨大贡献。RNAi是迅速发展起来的一种新兴基因阻断技术,近年来,在作物防治病虫害和品质改良方面取得了显著成效,商... 转基因技术作为现代生物技术的重要组成部分,在缓解资源匮乏、提高粮食产量、保护生态环境安全、拓展农业功能等方面做出巨大贡献。RNAi是迅速发展起来的一种新兴基因阻断技术,近年来,在作物防治病虫害和品质改良方面取得了显著成效,商业化应用已成为现实。因此,基于RNAi的转基因作物研发现状越来越受到人们的关注。本文就已产业化的RNAi转基因产品、RNAi转基因植物的研究进展及对RNAi转基因作物安全评价研究展望进行综述。 展开更多
关键词 核酸干扰技术 转基因作物 基因沉默 安全评价
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核盘菌γ-谷氨酰磷酸还原酶基因SsGPR1的功能分析 预览
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作者 杜娇 王娅波 +4 位作者 李雪华 黄志强 杨宇衡 毕朝位 余洋 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第19期3694-3703,共10页
【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘... 【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘菌的生长发育与致病机理打下基础,并为作物菌核病的绿色防控提供线索。【方法】通过BLAST进行蛋白同源比对分析,并利用MEGA 5.0软件构建蛋白进化树。通过实时荧光RT-PCR检测SsGPR1在核盘菌菌丝生长、菌核发育和萌发的各个阶段以及致病不同时期的表达模式。根据RNA干扰原理构建SsGPR1的沉默载体,通过PEG介导原生质体转化的方法将沉默载体转入到野生型核盘菌菌株1980中。利用实时荧光RT-PCR鉴定基因沉默转化子,对沉默转化子的菌丝形态、生长速度和菌核形成等表型进行观察,并测定沉默转化子在氧化胁迫条件下的菌丝生长。将沉默转化子分别接种至活体油菜叶片和拟南芥植株,观察并测量病斑大小。通过酸性茚三酮法对沉默转化子中的游离脯氨酸进行测定。【结果】核盘菌SsGPR1全长1 454 bp,编码449个氨基酸,在氨基酸H^10-N^426处含有谷氨酰磷酸还原酶结构域。同源比对发现SsGPR1蛋白与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的BC1G_13183蛋白和白霉病菌(Sclerotinia borealis)的SBOR_2215蛋白相似性最高,氨基酸序列一致性分别达95%和94%,系统进化树结果表明三者聚为一个小的分支。SsGPR1在核盘菌菌丝生长时期的表达量较高,在菌核不同发育阶段表达量相近,但均低于菌丝生长时期。SsGPR1在致病时期表达量不断升高,在接种后9 h表达量最高。将SsGPR1基因沉默载体pSIGPR1导入到核盘菌野生型菌株中,并通过实时荧光RT-PCR检测不同转化子中SsGPR1的表达水平,结果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149为SsGPR1基因沉默转化子。沉默转化子在PDA培养基上形成的菌核数量及均重与野� 展开更多
关键词 核盘菌 脯氨酸 γ-谷氨酰磷酸还原酶 基因沉默 致病性 氧化压力
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