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慢病毒介导HIF-1α 沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
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作者 李国平 刘丽璇 +3 位作者 蒲泽锦 胡敏敏 黄聪武 吴灵飞 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期27-32,104共7页
目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病... 目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。 展开更多
关键词 慢病毒 SHRNA RNA干扰 HEPG2细胞 HIF-1Α
HIP1因沉默对人食管癌EC109细胞迁移侵袭能力的影响 预览
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作者 冯征 王雪娇 +5 位作者 文苗苗 夏靖华 张晏宁 张娇 张志培 孙盈 《临床与病理杂志》 2019年第6期1159-1165,共7页
目的:研究亨廷顿蛋白相互作用蛋白1(Huntingtin interacting protein 1,HIP1)基因沉默对人食管癌EC109细胞迁移侵袭的影响。方法:构建慢病毒干扰HIP1的食管癌细胞系,定量PCR和蛋白质印迹法检测HIP1基因沉默效果。通过细胞划痕实验和Tran... 目的:研究亨廷顿蛋白相互作用蛋白1(Huntingtin interacting protein 1,HIP1)基因沉默对人食管癌EC109细胞迁移侵袭的影响。方法:构建慢病毒干扰HIP1的食管癌细胞系,定量PCR和蛋白质印迹法检测HIP1基因沉默效果。通过细胞划痕实验和Transwell迁移侵袭试验研究HIP1基因沉默对人食管癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果:慢病毒转染EC109食管癌细胞后,HIP1基因沉默效率达到80%以上。qRT-PCR和蛋白质印迹法证实此次慢病毒干扰HIP1效果显著。细胞划痕试验和Transwell迁移侵袭试验显示HIP1基因沉默后可抑制EC109食管癌细胞的迁移和侵袭。结论:构建的HIP1干涉慢病毒表达载体可抑制HIP1基因和蛋白的表达,并可有效抑制EC109食管癌细胞迁移和侵袭,提示HIP1作为食管癌的差异蛋白,可能通过促进食管癌细胞的转移参与食管癌的发生发展。 展开更多
关键词 亨廷顿蛋白相互作用蛋白1 慢病毒干扰 迁移与侵袭 食管癌
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PTEN调控大鼠原始卵泡启动和生长 预览
3
作者 洪雯丽 黄瑶琪 +4 位作者 祝费隐 郑月慧 李佳 戴峻 张立霞 《基础医学与临床》 CSCD 2019年第8期1077-1084,共8页
目的探讨PTEN对大鼠原始卵泡激活和生长的调控作用和机制。方法2日龄大鼠卵巢在Waymouth培养系统中培养0、4和8d,用HE染色检测慢病毒PTENsiRNA的沉默效率及其对原始卵泡生长启动情况。同步用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化... 目的探讨PTEN对大鼠原始卵泡激活和生长的调控作用和机制。方法2日龄大鼠卵巢在Waymouth培养系统中培养0、4和8d,用HE染色检测慢病毒PTENsiRNA的沉默效率及其对原始卵泡生长启动情况。同步用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色检测PTENmRNA和蛋白在卵泡生长中的表达和动态变化;用慢病毒PTEN-shRNA沉默卵巢中PTEN表达后,观察对原始卵泡启动生长及雌二醇和孕酮分泌的影响;此外,利用PI3K抑制剂LY294002探讨了PTEN在原始卵泡形成过程中的可能信号通路。结果PTENmRNA和蛋白在原始卵泡中均有表达,随着原始卵泡的发育,其表达水平降低(P<0.01);经PTEN-shRNA慢病毒转染后,荧光成像显示慢病毒在体外已成功转染到卵巢组织,HE染色显示原始卵泡数量减少(P<0.01),表明PTEN参与了原始卵泡的起始。结论PTEN可通过PI3K信号通路和调节雌、孕激素分泌调控原始卵泡发育。它在原始卵泡的发育启动中起着重要的作用。 展开更多
关键词 PTEN 原始卵泡 慢病毒 RNA干扰
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蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达 预览
4
作者 生欣 王俊华 +3 位作者 刘月华 郜双林 谢夏丹 范芳 《中国现代医学杂志》 CAS 2019年第1期15-22,共8页
目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链... 目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;②以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(hUVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。③通过qRT-PCR与Western blotting检测分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果①插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。②病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×10^8、2×10^8和1×10^8TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。③干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P<0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs中稳定表达。 展开更多
关键词 蓬乱蛋白2/Wnt蛋白质类 慢病毒载体 内皮细胞 RNA干扰 过表达
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一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用 预览
5
作者 赵思捷 朱文琦 +7 位作者 孙杰 侯俊 王友亮 李永利 李波 鲍春梅 张浩 李伯安 《生物技术通讯》 CAS 2019年第4期528-532,共5页
目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx)mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒... 目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx)mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。 展开更多
关键词 G418抗性 慢病毒载体 RNA干扰 乙型肝炎病毒X基因
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PRIM1干扰慢病毒载体构建 预览
6
作者 卢海 江金群 孟镔 《局解手术学杂志》 2018年第11期775-777,共3页
目的构建PRIM1基因的干扰慢病毒载体,供后续深入研究PRIM1基因在肿瘤形成中的机制。方法以PRIM1基因为模板,按照RNA序列设计原则,完成RNA干扰靶点设计后,构建RPIM1基因RNA干扰慢病毒成含干扰序列的单链DNA oligo,退火配对产生双链DNA;... 目的构建PRIM1基因的干扰慢病毒载体,供后续深入研究PRIM1基因在肿瘤形成中的机制。方法以PRIM1基因为模板,按照RNA序列设计原则,完成RNA干扰靶点设计后,构建RPIM1基因RNA干扰慢病毒成含干扰序列的单链DNA oligo,退火配对产生双链DNA;随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体;将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子,送测序验证,对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提。结果对RNA序列设计软件评估后选取的干扰靶点序列,经过退火配对得到具有带黏性末端的双链的DNA; Age I和EcoRI双酶切使GV115载体线性化;双链DNA oligo与线性化的载体连接的产物经PCR扩增后的序列与目标序列完全一致,获得测序结果正确的阳性克隆质粒。结论以PRIM1基因为模板,按照载体设计构建常规方法成功构建PRIM1干扰慢病毒载体。 展开更多
关键词 载体 慢病毒 干扰 PRIM1基因 肿瘤
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慢病毒介导MCF-7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立 预览
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作者 谭拥军 郭明月 +1 位作者 向勤 李谕 《湖南大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2018年第6期128-132,共5页
为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48 h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因m... 为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48 h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平,Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体,从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株,为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料。 展开更多
关键词 FOXP2 慢病毒载体 RNA干扰 乳腺癌MCF-7细胞
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PC4基因RNAi慢病毒载体的构建及有效靶序列鉴定 预览 被引量:1
8
作者 张真中 杨春杰 +2 位作者 钱三立 李冰玉 邹云增 《中国临床医学》 2018年第3期427-430,共4页
目的:筛选慢病毒介导PC4 RNA干扰的有效靶序列。方法:通过数据库设计3条PC4干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,转入HEK-293T细胞后,感染H9C2心肌细胞。通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰PC4的效果。结果:... 目的:筛选慢病毒介导PC4 RNA干扰的有效靶序列。方法:通过数据库设计3条PC4干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,转入HEK-293T细胞后,感染H9C2心肌细胞。通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰PC4的效果。结果:成功构建shPC4慢病毒载体,获得高效感染心肌细胞的慢病毒;感染心肌细胞后实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹显示,shPC4-1具有较高的干扰效果(P〈0.05)。结论:成功筛选出高效的PC4RNAi靶序列。 展开更多
关键词 PC4 慢病毒 RNA干扰 心肌细胞
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大鼠脊髓钝挫伤后IL-6和Vim对运动功能恢复的影响 预览
9
作者 向阳 钟占琼 +2 位作者 文山 祝琦 张晓 《成都医学院学报》 CAS 2017年第6期666-673,共8页
目的用慢病毒干扰白介素6(interleukin-6,IL-6)的表达,观察脊髓钝挫伤(spinalcordcontusion,SCC)后波形蛋白(Vim)的表达变化及其对大鼠运动功能恢复的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组(sham组),SCC实验组(SCC组),载体组(vetor组)和... 目的用慢病毒干扰白介素6(interleukin-6,IL-6)的表达,观察脊髓钝挫伤(spinalcordcontusion,SCC)后波形蛋白(Vim)的表达变化及其对大鼠运动功能恢复的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组(sham组),SCC实验组(SCC组),载体组(vetor组)和慢病毒组(IL-6-RNAi-LV组)。改良Allen's法制备SCC模型,BBB评分评估术后大鼠的运动功能变化,免疫组织化学技术(IHC)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测IL-6、Vim的蛋白质定位和mRNA的表达变化。GeneMANIA预测IL-6和Vim的关系后构建慢病毒干扰IL-6的SCC模型进一步实验。结果BBB评分显示SCC组,IL-6-RNAi-LV组,Vetor组在术后5、7、14、28d较Sham组明显下降(P<0.05),而IL-6-RNAi-LV组在第5、7、14、28天的评分较Vetor组有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。IHC结果显示IL-6和Vim表达在脊髓神经元中。另外,IL-6mRNA在SCC后12h达到峰值(P<0.05),VimmRNA在SCC后7、14、28d较sham组增高,进一步抑制IL-6后其在28d与vector组相比有明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论在SCC后,抑制IL-6表达可以下调Vim,抑制胶质瘢痕形成,进而促进SD大鼠的运动功能恢复。 展开更多
关键词 脊髓钝挫伤 慢病毒 RNA干扰 IL-6 VIM 运动功能
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靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表达质粒的构建及功能验证 预览
10
作者 张晓艳 温春燕 +2 位作者 吕玉华 陈豪 佘菲菲 《福建医科大学学报》 北大核心 2017年第3期139-145,共7页
目的构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响。方法设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒V... 目的构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响。方法设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒VSVG一起采用磷酸钙法转染293T细胞包装慢病毒,收集制备的慢病毒感染AGS细胞,用抗生素Puromycine进行筛选。Western-blot检测感染细胞YWHAE蛋白的表达。选取干扰效率最高的慢病毒表达质粒,针对性设计siRNA的点突变引物,重叠延伸PCR法扩增获得点突变的YWHAE基因,克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体,构建YWHAE点突变的表达质粒,转染YWHAE沉默效果最好的AGS细胞株,Western-blot检测转染细胞YWHAE蛋白的回复表达。采用MTS法检测YWHAEshRNA慢病毒对AGS细胞增殖的影响。结果5对针对人YWHAE基因的shRNA序列构建的慢病毒中,pLL3.7-siYWHAE-5包装成的慢病毒抑制AGS细胞的YWHAE蛋白表达的效果最明显,仅为对照组相对表达量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包装的慢病毒,其干扰效应可经由YWHAE点突变表达质粒回复。与对照组比较,YWHAE-shRNA组AGS细胞增殖能力明显下降。结论成功构建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,获得YWHAE基因表达显著下调的AGS细胞株;探明YWHAE表达的下调可有效抑制AGS细胞的增殖,提示YWHAE在胃癌中的致癌潜能。 展开更多
关键词 慢病毒属 RNA干扰 胃肿瘤 细胞增殖
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猪Utx慢病毒过表达/干扰载体的构建和病毒包装 预览
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作者 闫海龙 陈晓旭 +3 位作者 朱晋生 张鹏飞 李爽 曾文先 《家畜生态学报》 北大核心 2017年第8期7-13,共7页
UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过... UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。 展开更多
关键词 组蛋白去甲基化 Utx SHRNA 慢病毒 过表达载体 干扰载体
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慢病毒介导稳定敲低Smurf1细胞株的构建及对细胞迁移的影响 预览
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作者 韦荣飞 郭静 +3 位作者 李梦媛 朱瑞敏 杨星九 高苒 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2017年第4期46-51,共6页
目的构建慢病毒介导稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株并检测敲低Smurf1细胞迁移的影响。方法将包装好的Smurf1敲低慢病毒感染HeLa和A549细胞,7 d后进行嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞,Western blot和qPCR检测敲低效果,并进行Transwell检测Sm... 目的构建慢病毒介导稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株并检测敲低Smurf1细胞迁移的影响。方法将包装好的Smurf1敲低慢病毒感染HeLa和A549细胞,7 d后进行嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞,Western blot和qPCR检测敲低效果,并进行Transwell检测Smurf1敲低对细胞迁移的影响。结果利用干扰慢病毒系统成功构建稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株,稳定敲低Smurf1抑制细胞的迁移速率。结论敲低Smurf1抑制细胞迁移。 展开更多
关键词 Smurf1 慢病毒 RNA干扰 细胞迁移
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ALDH2 shRNA质粒构建及其对酒精致HepG2细胞毒性的影响
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作者 郭涛 王婷 +4 位作者 王飞 曾妮 李若碧 江红梅 王庆 《热带医学杂志》 CAS 2017年第4期416-420,F0004共6页
目的构建抑制人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因表达的shALDH2-PLKO.1重组慢病毒质粒,并将重组质粒转染HepG2细胞株,为构建ALDH2基因沉默细胞株及研究ALDH2在酒精致HepG2细胞毒性中的作用奠定基础。方法设计3对ALDH2 sh RNA序列并插入到PLKO.1... 目的构建抑制人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因表达的shALDH2-PLKO.1重组慢病毒质粒,并将重组质粒转染HepG2细胞株,为构建ALDH2基因沉默细胞株及研究ALDH2在酒精致HepG2细胞毒性中的作用奠定基础。方法设计3对ALDH2 sh RNA序列并插入到PLKO.1-GFP载体中,通过测序鉴定。将ALDH2 sh RNA和包装质粒共转染293FT细胞,收集24、48和72 h病毒液进行浓缩,通过梯度稀释法测定病毒液滴度。Western blot和qRTPCR检测转染sh RNA的HepG2细胞ALDH2蛋白和mRNA表达量。MTS比色法检测转染sh RNA的HepG2细胞在酒精染毒后的增殖能力。结果测序结果显示shALDH2-PLKO.1质粒构建成功;滴度测定结果显示包装系统成功包装出病毒颗粒,病毒滴度为:4×107TU/ml;Western blot及qRT-PCR结果显示,与对照组比较,转染了shALDH2-1和shALDH2-3的HepG2细胞蛋白和mRNA表达量明显下调,其中shALDH2-1组抑制率为51%(P=0.046),shALDH2-3组抑制率为72%(P=0.008),差异有统计学意义;MTS结果显示转染sh RNA的HepG2细胞株酒精染毒后细胞增殖能力明显下降。结论成功构建了靶向ALDH2基因的重组慢病毒表达质粒,而且shALDH2-PLKO.1可以有效抑制He PG2细胞中ALDH2基因的表达,为研究ALDH2基因在酒精性肝病和肝癌中的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 ALDH2 慢病毒质粒 RNA干扰 酒精性肝脏疾病
在表达HCV Core蛋白的肝癌细胞中建立Notch1低表达稳定转染细胞株 预览
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作者 赵林莉 李卓 +5 位作者 陈石蕊 姚敏 秦岭 党品香 高欢 吕欣 《微生物学免疫学进展》 2017年第6期50-55,共6页
目的筛选并包装Notch1基因shRNA低表达的慢病毒,感染稳定表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)的肝癌细胞,在此基础上建立低表达Notch1基因的SMMC7721-Core稳定转染细胞株。方法设计针对Notch1基因mRNA的干扰序列... 目的筛选并包装Notch1基因shRNA低表达的慢病毒,感染稳定表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)的肝癌细胞,在此基础上建立低表达Notch1基因的SMMC7721-Core稳定转染细胞株。方法设计针对Notch1基因mRNA的干扰序列,并将其连接入载体质粒,转染HEK293T细胞,构建带有Notch1基因的慢病毒表达载体,感染稳定表达HCV Core蛋白的人肝癌细胞株SMMC7721-Core,采用定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测干扰效果。结果构建了带有干扰Notch1基因的慢病毒表达载体,感染SMMC7721-Core细胞后筛选获得稳转细胞株,qPCR测得Notch1 mRNA低表达,Western blot检测到Notch1蛋白低表达。结论成功构建了Notch1低表达SMMC7721-Core人肝癌稳定转染细胞株,为进一步开展对HCV Core蛋白诱导肝癌过程中Notch1所起作用的研究提供了依据。 展开更多
关键词 NOTCH1 丙型肝炎病毒 肝癌细胞株 慢病毒 干扰
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In vivo Inhibitory Effect of Lentivirus-mediated RNA Interference Targeting RhoC on Growth of SKOV3 Cells
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作者 PAN Ying WANG Ke +5 位作者 LIU Yiehen QIN Rui CAO Lu WANG Jia ZHOU Guanghong ZHANG Aichen 《高等学校化学研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2017年第3期388-391,共4页
关键词 RNA干扰 细胞生长 慢病毒 体内 生长抑制 介导 oC基因 表达载体
敲低核蛋白1(NUPR1)基因抑制人U266多发性骨髓瘤细胞增殖并促进其凋亡 被引量:1
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作者 曾沉思 易蓓 +1 位作者 李星欣 陈建斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第9期1240-1246,共7页
目的构建核蛋白1-短发夹RNA(NUPR1-sh RNA)慢病毒载体定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下调对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响。方法以正常浆细胞为对照,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测骨髓瘤U266细胞和RPMI8226细胞的N... 目的构建核蛋白1-短发夹RNA(NUPR1-sh RNA)慢病毒载体定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下调对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响。方法以正常浆细胞为对照,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测骨髓瘤U266细胞和RPMI8226细胞的NUPR1 m RNA水平。设计针对NUPR1基因的sh RNA并包装慢病毒载体感染U266细胞,流式细胞术观察转染效率,q RT-PCR、Western blot法验证NUPR1基因干扰效果,CCK-8法及台盼(trypan)蓝染色检测细胞增殖,流式细胞术及Hoechst染色观察细胞凋亡。结果与正常人浆细胞相比,U266、RPMI8226细胞NUPR1 m RNA水平较高;U266细胞慢病毒感染效率达80%,NUPR1-sh RNA慢病毒载体构建成功。敲低NUPR1水平后,U266细胞增殖减弱,抑制率高达(58.71±1.64)%;与阴性对照组和空白对照组相比,敲低NUPR1水平后,U266细胞凋亡率明显增加。结论敲低U266细胞NUPR1水平后,可明显抑制U266细胞增殖并促进其凋亡。 展开更多
关键词 核蛋白1(NUPR1) 多发性骨髓瘤 慢病毒 RNA干扰
慢病毒介导2型阿诺碱受体RNA干扰有效靶序列的筛选 预览 被引量:1
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作者 杨春杰 丁志文 +1 位作者 龚惠 邹云增 《中国临床医学》 2016年第3期399-401,共3页
目的:筛选慢病毒介导2型阿诺碱受体(RyR-2)RNA干扰的有效靶序列。方法:设计5条RyR-2干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,在HEK-293T细胞中包装成慢病毒,感染心肌细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰Ry... 目的:筛选慢病毒介导2型阿诺碱受体(RyR-2)RNA干扰的有效靶序列。方法:设计5条RyR-2干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,在HEK-293T细胞中包装成慢病毒,感染心肌细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰RyR-2的效果。结果:通过数据库获得5条RyR-2干扰靶序列,成功构建shRyR-2慢病毒载体,获得高效感染心肌细胞的慢病毒;感染心肌细胞后实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹显示shRyR-2_1007具有较高的干扰效果(P〈0.05)。结论:成功筛选出高效的RyR-2RNA干扰靶序列。 展开更多
关键词 2型阿诺碱受体 慢病毒 RNA干扰
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鞘氨醇激酶1干扰慢病毒载体及干扰慢病毒的构建
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作者 高瞻 王娟 +2 位作者 杨志华 白雅丽 哈小琴 《中国医药》 2016年第5期752-756,共5页
目的 构建人鞘氨醇激酶1(SPK1)干扰慢病毒载体,并制备SPK1干扰慢病毒.方法 将1 ~5号pLKO.2-shSPK1质粒及pLKO.1-Scramble-RFP对照质粒转染人胚肾293(HEK293)细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测pLKO.2-shSPK1质粒对SPK1的干... 目的 构建人鞘氨醇激酶1(SPK1)干扰慢病毒载体,并制备SPK1干扰慢病毒.方法 将1 ~5号pLKO.2-shSPK1质粒及pLKO.1-Scramble-RFP对照质粒转染人胚肾293(HEK293)细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测pLKO.2-shSPK1质粒对SPK1的干扰效率,筛选干扰效果最好的pLKO.2-shSPK1质粒;将所筛选质粒中以SPK1为靶点的短发夹结构RNA(SPK1-shRNA)插入pLKO.1-Scramble-GFP质粒中,获得表达shRNA-SPK1的pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒;将该质粒进行测序及酶切鉴定后,转染HEK293细胞48 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察绿色荧光强度,qRT-PCR检测其对SPK1的干扰效率.将pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒进行慢病毒包装及滴度检测.结果 与pLKO.1-Scramble-RFP对照质粒比较,转染1~5号pLKO.2-shSPK1质粒的HEK293细胞中SPK1 mRNA水平均有一定程度降低,其中3号pLKO.2-shSPK1质粒干扰效果最好,选取其进行pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒构建,经测序及酶切检验,证明重组质粒构建成功.pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒转染HEK293细胞后,绿色荧光阳性率达94.4%,SPK1 mRNA水平明显下降(P<0.01),干扰率达51.0%.进行慢病毒包装后测得病毒滴度为6×10^8 pfu/ml.结论 本研究成功构建了人SPK1干扰慢病毒载体,并制备了SPK1干扰慢病毒. 展开更多
关键词 鞘氨醇激酶1 慢病毒 RNA干扰
RNAi慢病毒表达对小鼠海马CA1神经元电生理功能的影响 预览 被引量:2
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作者 赵迎亚 陈露岚 王云 《扬州大学学报:农业与生命科学版》 CAS 北大核心 2016年第4期9-14,共6页
采用立体定位注射方法使小鼠海马脑区CA1区域感染以U6为启动子表达EGFP(pU6-EGFP)的特异性感染神经元的RNA干扰(RNAi)慢病毒颗粒(pU6-EGFP),2~3周后在离体海马脑片上应用膜片钳与场电位记录方法研究CA1锥体神经元在电生理特性、... 采用立体定位注射方法使小鼠海马脑区CA1区域感染以U6为启动子表达EGFP(pU6-EGFP)的特异性感染神经元的RNA干扰(RNAi)慢病毒颗粒(pU6-EGFP),2~3周后在离体海马脑片上应用膜片钳与场电位记录方法研究CA1锥体神经元在电生理特性、突触传递以及突触可塑性方面的变化。结果表明:pU6-EGFP慢病毒注射后未对海马Schaffer collateral-CA1基本突触传递功能、突触可塑性功能、锥体神经元膜电位及放电特性(静息膜电位、动作电位阈值、可以诱发动作电位的阈电流)产生影响。说明pU6-EGFP慢病毒注射后对小鼠海马脑片细胞电生理功能没有产生影响,因此应用其脑内注射方法进行中枢神经系统功能学领域的研究是可行的。 展开更多
关键词 慢病毒 启动子 电生理功能 RNA干扰 EGFP 海马体
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敲低SET7慢病毒载体的构建及对乳腺癌细胞生长的影响 被引量:1
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作者 周蕾 姜妮 +2 位作者 王小利 刘婕 丁丽华 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期897-900,共4页
目的:为了探讨组蛋白甲基转移酶SET7在乳腺癌发生发展中的功能,构建SET7基因的RNA干扰( RNAi)慢病毒表达载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法根据人SET7的cDNA序列,设计SET7基因短发夹RNA(shRNA)引物,并克隆到pSIH... 目的:为了探讨组蛋白甲基转移酶SET7在乳腺癌发生发展中的功能,构建SET7基因的RNA干扰( RNAi)慢病毒表达载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法根据人SET7的cDNA序列,设计SET7基因短发夹RNA(shRNA)引物,并克隆到pSIH-H1-Puro载体上,包装成慢病毒,感染人乳腺癌细胞ZR75-1,通过实时定量( real-time) PCR以及Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低SET7对ZR75-1细胞生长的影响。结果 DNA测序结果表明,SET7 shRNA慢病毒表达载体构建成功。实时定量PCR和Western印迹结果显示, SET7 shRNA能有效抑制SET7基因的表达。生长曲线实验表明,敲低SET7可抑制人乳腺癌细胞ZR75-1的生长。结论成功构建了SET7 shRNA慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞ZR75-1后,有效抑制了内源SET7基因的表达,敲低SET7能抑制ZR75-1细胞的生长,为进一步研究SET7在乳腺癌中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 SET7基因 慢病毒载体 RNA干扰 乳腺肿瘤
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