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短乳杆菌天然质粒分类 预览
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作者 孙大庆 李洪飞 +1 位作者 杨健 宋大巍 《食品科学》 CSCD 北大核心 2018年第10期173-178,共6页
为建立短乳杆菌天然质粒分类方法,通过质粒复制起始蛋白(replication initiation protein,Rep)进化树和基因组共线性分析,将短乳杆菌51个天然质粒可以准确、有效地划分为6个家族类型和11个亚家族类型,并在家族4质粒中发现了一种新的... 为建立短乳杆菌天然质粒分类方法,通过质粒复制起始蛋白(replication initiation protein,Rep)进化树和基因组共线性分析,将短乳杆菌51个天然质粒可以准确、有效地划分为6个家族类型和11个亚家族类型,并在家族4质粒中发现了一种新的复制子类型。研究结果表明,质粒Rep进化树和基因组共线性分析都是短乳杆菌天然质粒有效的分类方法,分类结果为今后短乳杆菌天然质粒科学分类和理性应用提供了理论研究依据。 展开更多
关键词 短乳杆菌 质粒 复制起始蛋白 基因组共线性 复制子
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植物乳杆菌天然质粒分类 预览 被引量:1
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作者 孙大庆 李洪飞 +1 位作者 宋大巍 杨建 《食品科学》 CSCD 北大核心 2017年第12期69-74,共6页
为建立植物乳杆菌天然质粒分类方法,以质粒复制起始蛋白(replicationinitiationprotein,Rep)作为分类标记,通过系统进化树分析方法,将植物乳杆菌53个编码Rep天然质粒划分为6个质粒类型,包括5个质粒家族和1个新的复制类型质粒,... 为建立植物乳杆菌天然质粒分类方法,以质粒复制起始蛋白(replicationinitiationprotein,Rep)作为分类标记,通过系统进化树分析方法,将植物乳杆菌53个编码Rep天然质粒划分为6个质粒类型,包括5个质粒家族和1个新的复制类型质粒,之后进一步提出了每个质粒家族特有的骨干序列,最终建立了一种简单、有效的植物乳杆菌天然质粒的分类方法和标准。与以往质粒功能和不相容性分类方法相比较,本方法具有较好的实用性和通用性。 展开更多
关键词 植物乳杆菌 质粒 基因组 复制起始蛋白 复制子
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表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建
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作者 袁红 李平花 +12 位作者 袁子文 白兴文 孙普 马雪青 李坤 寻广谨 卢曾军 包慧芳 陈应理 曹轶梅 付元芳 张婧 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1746-1752,共7页
【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制... 【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 EGFP 口蹄疫病毒 复制子
HCV亚基因组复制子细胞培养上清外泌体HCV RNA的分离及其与胞内病毒水平的相关性
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作者 王江华 费然 +2 位作者 王雪艳 张海莹 魏来 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第1期17-21,共5页
目的检测丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞培养上清中外泌体HCV RNA的稳定性和表达水平,并研究干扰素α抑制HCV复制过程中,外泌体HCV RNA水平与胞内病毒复制水平的相关性。方法建立G418筛选稳定表达的HCV复制子细胞模型HCV-Con I-Rep,比... 目的检测丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞培养上清中外泌体HCV RNA的稳定性和表达水平,并研究干扰素α抑制HCV复制过程中,外泌体HCV RNA水平与胞内病毒复制水平的相关性。方法建立G418筛选稳定表达的HCV复制子细胞模型HCV-Con I-Rep,比较超速离心和沉淀法对HCV RNA阳性外泌体的分离效果;实时定量PCR法检测培养上清的HCV RNA水平并评价其对表面活性剂NP-40和RNase A的敏感性;不同剂量干扰素α(0、0.4、2、10、50、250IU/ml)处理72h或100IU/ml干扰素α处理不同时间(0、6、12、24、48、72h),分别检测上清和胞内HCV RNA水平,并评价两者的相关性。结果成功构建了稳定表达的HCV复制子细胞模型;PEG沉淀较超速离心法能够更高效地分离外泌体;HCV复制子细胞培养上清外泌体中含有较高水平(~106 IU/ml)的HCV RNA,但在表面活性剂的存在下,可因外泌体脂质膜破坏而被RNase A降解;干扰素α处理过程中,胞内HCV RNA和上清中外泌体HCV RNA水平均显著降低;Spearman相关性分析提示,胞内HCV RNA和上清中外泌体HCV RNA在不同剂量干扰素处理组和不同处理时间组的水平均具有显著相关性(r=0.9690,P〈0.01和r=0.7069,P=0.001)。结论 HCV亚基因组复制子细胞培养上清外泌体HCV RNA水平可作为更方便检测的指标,反映胞内病毒复制水平的变化。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 复制子 外泌体 干扰素Α
猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析 预览 被引量:3
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作者 王晓杜 赵凡凡 +4 位作者 代兵 邵东华 蒋春英 周圻 马志永 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期111-118,共8页
猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非... 猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列,插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV,实时定量PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白(NS3)表达,验证复制子的自主复制能力。在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-JEV-EGFP、pAC-JEV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ΔNS5,该复制子载体转染BHK-21,荧光显微镜直接观察EGFP表达,Western blotting方法检测外源蛋白质(GFP、GP5、HA)表达情况。结果表明:随着转染时间延长,复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加,表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力。EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续8d以上,携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后,HA和GP5能有效表达,说明复制子具有表达外源蛋白质的能力。该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 复制子 表达载体 HA GP5
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HCV细胞培养系统及其在中草药提取物抗HCV研究中的应用 预览 被引量:3
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作者 李京涛 常占杰 +6 位作者 席奇 刘亚珠 宋春荣 南然 李日向 魏海梁 闫曙光 《临床肝胆病杂志》 CAS 2015年第1期115-117,共3页
应用中草药治疗丙型肝炎报道较多,然而这些研究大多采用中药复方制剂进行临床治疗,疗效局限。由于一种中药含有多种活性物质,某些物质之间在体内甚至有相互拮抗的作用,因此,对于治疗结果的作用机理很难阐述清楚。简述了HCV假病毒、复制... 应用中草药治疗丙型肝炎报道较多,然而这些研究大多采用中药复方制剂进行临床治疗,疗效局限。由于一种中药含有多种活性物质,某些物质之间在体内甚至有相互拮抗的作用,因此,对于治疗结果的作用机理很难阐述清楚。简述了HCV假病毒、复制子和全长细胞培养系统的研究现状,并对应用HCV RNA细胞模型研究中药单体或有效成分进行抗HCV实验研究的相关进展进行了综述,为中药治疗丙型肝炎研究提供新思路。 展开更多
关键词 肝炎 丙型 慢性 肝炎病毒属 中草药 细胞培养技术 复制子 综述
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乳酸乳球菌内源隐蔽性质粒序列分析及食品级克隆载体的构建
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作者 范丽平 张江 霍贵成 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第5期182-188,共7页
为构建乳酸菌食品级载体,对乳酸乳球菌内源隐蔽性质粒p KL001进行全序列测定、序列分析及PCR扩增,获得了该质粒的复制子。以Southern杂交对质粒p KL001复制模式进行分析,结果显示p KL001为θ型复制。将该复制子与镉抗性功能片段连接,构... 为构建乳酸菌食品级载体,对乳酸乳球菌内源隐蔽性质粒p KL001进行全序列测定、序列分析及PCR扩增,获得了该质粒的复制子。以Southern杂交对质粒p KL001复制模式进行分析,结果显示p KL001为θ型复制。将该复制子与镉抗性功能片段连接,构建了食品级克隆载体p KF168,其在受体菌株KLDS4.0319-5中可稳定存在。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 隐蔽性质粒 复制子 克隆载体
Tricistronic hepatitis C virus subgenomic replicon expressing double transgenes 预览
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作者 Xin Cheng Xiang-Cui Gao +7 位作者 Jun-Ping Wang Xin-Ying Yang Yan Wang Bao-Sheng Li Fu-Biao Kang Hai-Jun Li Yue-Min Nan Dian-Xing Sun 《世界胃肠病学杂志:英文版(电子版)》 SCIE CAS 2014年第48期18284-18295,共12页
AIM:To construct a tricistronic hepatitis C virus(HCV)replicon with double internal ribosome entry sites(IRESes)of only 22 nucleotides for each,substituting the encephalomyocarditis virus(EMCV)IRESes,which are most of... AIM:To construct a tricistronic hepatitis C virus(HCV)replicon with double internal ribosome entry sites(IRESes)of only 22 nucleotides for each,substituting the encephalomyocarditis virus(EMCV)IRESes,which are most often used as the translation initiation element to form HCV replicons.METHODS:The alternative 22-nucleotide IRES,RNA-binding motif protein 3 IRES(Rbm3 IRES),was used to form a tricistronic HCV replicon,to facilitate constructing HCV-harboring stable cell lines andsuccessive antiviral screening using a luciferase marker.Briefly,two sequential Rbm3 IRESes were inserted into bicistronic p UC19-HCV plasmid,consequently forming a tricistronic HCV replicon(p HCV-rep-Neo R-h Rluc),initiating the translation of humanized Renilla luciferase and HCV non-structural gene,along with HCV authentic IRES initiating the translation of neomycin resistance gene.The s H7 cell lines,in which the novel replicon RNA stably replicated,were constructed by neomycin and luciferase activity screening.The intracellular HCV replicon RNA,expression of inserted foreign genes and HCV non-structural gene,as well as response to anti-HCV agents,were measured in s H7 cells and cells transiently transfected with tricistronic replicon RNA.RESULTS:The intracellular HCV replicon RNA and expression of inserted foreign genes and HCV nonstructural gene in s H7 cells and cells transiently transfected with tricistronic replicon RNA were comparable to those in cells stably or transiently transfected with traditional bicistronic HCV replicons.The average relative light unit in p HCV-rep-Neo R-h Rluc group was approximately 2-fold of those in the p UC19-HCV-h RLuc and Tri-JFH1 groups(1.049×108±2.747×107 vs 5.368×107±1.016×107,P<0.05;1.049×108±2.747×107 vs 5.243×107±1.194×107,P<0.05),suggesting that the translation initiation efficiency of the first Rbm3 IRES in the two sequential IRESes was stronger than the HCV authentic IRES and EMCV IRES.The fold changes of 72 h/4 h relative light units in the p HCV-rep-Neo R-h Rluc and p UC19-HCV-h R 展开更多
关键词 Hepacivirus REPLICON Internal RIBOSOME ENTRY site
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HCV复制子与细胞培养体系研究进展 被引量:1
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作者 刘宁 冯悦 +2 位作者 张阿梅 岳蕾 夏雪山 《生命科学》 CSCD 2014年第8期858-865,共8页
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染所导致的传染性肝病,呈现世界性流行态势,严重危害人类健康。由于病毒自身高度突变,以及广泛高效的细胞培养体系和合适的小动物模型缺乏,目前尚无可有效预防的疫苗。自1989年丙... 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染所导致的传染性肝病,呈现世界性流行态势,严重危害人类健康。由于病毒自身高度突变,以及广泛高效的细胞培养体系和合适的小动物模型缺乏,目前尚无可有效预防的疫苗。自1989年丙型肝炎病毒基因组首次被确定以来,Con1(1b)亚基因组复制子和JFH1(2a)毒株细胞培养体系相继建立。以此为工具,HCV生活周期多个关键环节得以阐明。近年来,研究者在Con1亚基因组复制子、JFH1和J6/JFH1细胞培养体系的基础上,构建出多个基因型和亚型的复制子和细胞培养体系。不同的体系在HCV复制与致病机制研究、抗病毒药物筛选方面,具有不同的用途及优缺点。针对HCV复制子与细胞培养体系的研究进展进行综述,可为HCV的相关研究提供参考。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 复制子 基因型 嵌合体
含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达
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作者 陈中湘 刘晓蕾 +4 位作者 刘丽莎 崔光晶 邬国军 马琼山 刘水平 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第5期389-393,399共6页
目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子... 目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT—PCR方法检测重组复制子的HCVRNA负链,采用Westernblot检测HCVNS3蛋白的复制表达,并观察IFN—α对重组质粒表达的HCVRNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCVNS3蛋白表达。转染后48h,1000 IU/ml和2000Iu/ml IFN-α处理的细胞HCVRNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 复制子 绿色荧光蛋白 基因表达
O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定 预览 被引量:2
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作者 孙超 杨德成 +3 位作者 高荣远 周国辉 王海伟 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期611-614,共4页
为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基... 为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDVRep。将该复制子质粒线性化后,经体外转录制备复制子全长RNA,转染BHK-21细胞,通过RT-PCR方法和间接免疫荧光试验分别检测该复制子RNA的自主复制能力以及FMDV非结构蛋白3B的表达情况。结果显示,复制子RNA在BHK-21细胞中能够进行自主复制并且能够表达病毒的非结构蛋白。Rluc活性检测结果表明,该复制子RNA在BHK-21细胞中可以高效表达Rluc,在转染后2 h~12 h Rluc活性呈线性递增,进一步反映该复制子具有良好的表达外源基因的能力。O型FMDV亚基因组复制子的构建,为深入研究FMDV的复制和翻译机制奠定了基础。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 海肾萤光素酶 复制子
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质粒型甲病毒复制子载体系统的构建及其功能鉴定
12
作者 张凤娟 唐丽 +6 位作者 尉研 王焕琴 杨蕴芝 吴萌 张鹏 梁国栋 朱武洋 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2014年第3期233-235,共3页
目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-... 目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-160病毒质粒型复制子载体.将病毒核蛋白基因及包膜糖蛋白基因分别克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒.通过绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因的表达检验该质粒型载体系统的功能特性.结果 成功构建了包括复制子载体和辅助质粒的质粒型甲病毒复制子载体系统,且该复制子载体系统可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究构建了能够表达外源基因的质粒型甲病毒复制子载体系统,为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础. 展开更多
关键词 Sindbis病毒 复制子 基因
双荧光素酶标记丙型肝炎病毒亚基因组复制子细胞模型的建立 被引量:2
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作者 彭剑淳 高博 +5 位作者 王怡 付秋霞 樊炜 周欠欠 贾帅争 詹林盛 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期681-684,691共5页
目的构建双荧光素酶标记丙型肝炎病毒(HCV)亚基因组复制子细胞模型,为HCV研究提供有效工具。方法通过单克隆筛选及慢病毒感染构建双荧光素酶标记的HCV亚基因组复制子细胞模型(HCV Fluc-UbiGluc)。利用荧光素酶检测、Western印迹检... 目的构建双荧光素酶标记丙型肝炎病毒(HCV)亚基因组复制子细胞模型,为HCV研究提供有效工具。方法通过单克隆筛选及慢病毒感染构建双荧光素酶标记的HCV亚基因组复制子细胞模型(HCV Fluc-UbiGluc)。利用荧光素酶检测、Western印迹检测鉴定细胞模型,利用IFN-α对HCV抗病毒效果评价验证细胞模型的有效性。结果筛选所得HCV亚基因组细胞克隆检测到荧光素酶活性,Western印迹检测到HCV NS5A蛋白表达。NS3/4A对黄色荧光蛋白(YFP)标记的MAVS(YFP-MAVS)切割作用使亚细胞定位发生转移。IFN-α处理后荧光素酶活性、HCV蛋白表达水平明显降低。结论该模型采用萤火虫荧光素酶报告基因指示HCV亚基因组在细胞内的复制水平,Gaussia荧光素酶指示细胞的生长数量,能准确反映候选药物对HCV复制水平的影响,并有效排除药物的细胞毒性干扰,具有操作简单、快速等优点,在抗病毒药物高通量筛选、HCV致病机制等研究方面具有一定的价值。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 荧光素酶类 萤火虫 Gaussia荧光素酶 细胞模型 复制子
干扰素刺激基因ISG20抗丙型肝炎病毒的作用研究 被引量:2
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作者 徐华 雷宇 +4 位作者 钟珊 彭凤英 周智 李奎 任红 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期33-37,共5页
目的研究干扰素刺激基因ISG20对HCV的抑制作用及其机制,为探索丙型肝炎新的治疗方法提供依据。方法将含ISG20基因,其无功能突变体ISG20m和相应空白载体的质粒pcDNA3.1瞬时转染Huh7、Huh7.5和HEK293细胞,观察ISG20对HCV单顺反子复制... 目的研究干扰素刺激基因ISG20对HCV的抑制作用及其机制,为探索丙型肝炎新的治疗方法提供依据。方法将含ISG20基因,其无功能突变体ISG20m和相应空白载体的质粒pcDNA3.1瞬时转染Huh7、Huh7.5和HEK293细胞,观察ISG20对HCV单顺反子复制子pSGRm-JFHlblaRL的抑制作用。同时将含ISG20、IsG20m基因和相应空白质粒的逆转录病毒载体pCX4Bsr转染Huh7.5细胞,建立稳定表达该基因的细胞系。将pSGRm-JFHlblaRL复制子转染ISG20细胞系,观察IsG20对该复制子的抑制作用。用细胞培养产生的HCV感染R粥20细胞系,探索其对HCV复制滴度的影响。数据比较用两因素多水平重复测量的方差分析。结果成功构建了稳定表达ISG20及其突变体的细胞系7.5-ISG20、7.5-ISG20m和质粒对照7.5-Bsr,免疫荧光证实ISG20和ISG20m表达于细胞质和细胞核。pSGRm-JFHlblaRLRNA在7.5-ISG20细胞中的复制被严重抑制,在所检测的各个时间点,其复制水平为7.5-ISG20m和7.5一Bsr细胞中的9.1%~16.7%。在Huh7、Huh7.5和HEK293细胞中,瞬时表达的ISG20对HCV复制子RNA也有明显的抑制作用,其复制水平为对照的16.7%~25.0%。HCV在7.5-ISG20细胞中扩增得到相似的结果,在感染后48~72h,HCV在7.5-ISG20细胞上清液中的滴度为7.5-ISG20m和7.5-Bsr细胞中的9.1%~12.5%。Westernblot实验结果显示,7.5-ISG20细胞中HCV杨心蛋白表达也明显减少。结论ISG20无论在瞬时转染的细胞和稳定表达的细胞系中均能抑制HCV复制子复制,并能减少HCV的扩增,这种抑制作用与ISG20的核酸外切酶作用密切相关。 展开更多
关键词 干扰素 肝炎病毒 丙型 复制子 ISG20 体外研究
Development and Characterization of West Nile Virus Replicon Expressing Secreted Gaussia Luciferase 预览
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作者 Chao Shan Xiaodan Li +5 位作者 Chenglin Deng Baodi Shang Linlin Xu Hanqing Ye Zhiming Yuan Bo Zhang 《中国病毒学:英文版》 CAS CSCD 2013年第3期161-166,共6页
我们开发了韦斯特尼罗河病毒(WNV ) 的 Gaussia 酶(Gluc ) 记者 replicon 并且使用了它确定病毒的翻译和 RNA 复制。Gluc replicon 的优点是 Gaussia 酶与 Gluc replicon RNA 从房间 transfected 被分泌进文化媒介,并且媒介能为酶活动... 我们开发了韦斯特尼罗河病毒(WNV ) 的 Gaussia 酶(Gluc ) 记者 replicon 并且使用了它确定病毒的翻译和 RNA 复制。Gluc replicon 的优点是 Gaussia 酶与 Gluc replicon RNA 从房间 transfected 被分泌进文化媒介,并且媒介能为酶活动直接是 assayed。用一个已知的 Flavivirus 禁止者(NITD008 ) ,我们证明 Gluc-WNV replicon 能被用于抗病毒的屏蔽。Gluc-WNV-Rep 将为在抗病毒的药发展节目的研究,以及为学习 WNV 的病毒的复制和致病是有用的。 展开更多
关键词 西尼罗河病毒 荧光素酶 药物开发 细胞分泌 复制子 表征 病毒复制 病毒抑制剂
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西尼罗病毒RNA复制子系统的建立与应用
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作者 张富军 李晓峰 +6 位作者 曹飞 赵慧 邓永强 朱舜亚 姜涛 秦鄂德 秦成峰 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期114-117,共4页
目的构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子。方法在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3’UTR端引入PacI酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep。同时,将增强型绿色荧光蛋白(e... 目的构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子。方法在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3’UTR端引入PacI酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep。同时,将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和海肾荧光素酶(R.luc)报告基因分别插入上述复制子质粒中,获得含有报告基因的复制子pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.luc。将上述克隆线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK.21细胞,观察不同时间点绿色荧光蛋白(GFP)的活性和R.luc活性。结果与结论获得了WNV复制子pSP6-WNrep、pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.luc,酶切和测序鉴定结果显示,序列与预期一致。将含有报告基因的复制子转染细胞72h后仍能观察到荧光信号,R.luc的活性随时间延长而增强。本研究成功构建了WNVChin-01株的RNA复制子,该复制子能够在哺乳动物细胞中有效复制并表达外源蛋白,为下一步构建WNV单轮感染病毒样颗粒奠定了基础。 展开更多
关键词 RNA 西尼罗病毒 复制子 转染
华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析 预览 被引量:3
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作者 李京涛 周斌 +6 位作者 周元平 曾艳丽 李威 王俊洁 张健 张浩 刘叔文 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期 46-49,共4页
构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的replicon重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法 以能够高效复制的1b型HCV replicon质粒为骨架,构成带有MIu Ⅰ 和Bcl Ⅰ 双酶切位点的开关质粒,采用... 构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的replicon重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法 以能够高效复制的1b型HCV replicon质粒为骨架,构成带有MIu Ⅰ 和Bcl Ⅰ 双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIu Ⅰ 和Bcl Ⅰ 酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b replicon骨架中。 结果 成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将 NS5A区ISDR-V3区域置换入Replicon中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。 结论 成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的Replicon插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白5A 复制子系统 序列分析
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HCV细胞培养系统研究进展 预览
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作者 陈娜 刘叶红 刘敏 《传染病信息》 2012年第5期317-320,共4页
我国丙型肝炎患病率高,目前临床使用干扰素┼利巴韦林治疗,但仅对50%的HCV基因1型患者有效,因此急需有效的治疗方法。由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低,且病毒变异高,目前对HCV机制的研究仍处于初级阶段,至今尚未建立可靠、稳定的HC... 我国丙型肝炎患病率高,目前临床使用干扰素┼利巴韦林治疗,但仅对50%的HCV基因1型患者有效,因此急需有效的治疗方法。由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低,且病毒变异高,目前对HCV机制的研究仍处于初级阶段,至今尚未建立可靠、稳定的HCV动物模型及感染细胞系统。如能建立一个有效的体外复制系统,对研究HCV的附着、融合、内吞、入胞、复制、释放和发病机制等有重要意义。本文就近年来国内外出现的HCV体外感染细胞系统的研究新进展进行综述,重点对稳定性较好的HCV体外细胞培养模型和HCV假病毒感染颗粒加以阐述。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 病毒包膜蛋白质类 复制子
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重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫原性的分析 预览
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作者 马尧 李娜 +2 位作者 余云舟 孙志伟 俞炜源 《生物技术通讯》 CAS 2012年第1期 46-48,55,共4页
目的:构建携带炭疽毒素保护性抗原第四结构域(PA4)基因的重组Semliki森林病毒(SFV)复制子病毒颗粒,并对其免疫原性进行研究。方法:将编码炭疽PA4的SFV复制子DNA载体pSCAR-SPA4,与辅助SFV DNA载体pSHCAR共转染BHK21细胞,制备表达PA... 目的:构建携带炭疽毒素保护性抗原第四结构域(PA4)基因的重组Semliki森林病毒(SFV)复制子病毒颗粒,并对其免疫原性进行研究。方法:将编码炭疽PA4的SFV复制子DNA载体pSCAR-SPA4,与辅助SFV DNA载体pSHCAR共转染BHK21细胞,制备表达PA4的重组复制子病毒颗粒;用重组复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠,并采用ELISA法检测其血清抗体水平和细胞因子IFN-γ和IL-4。结果:免疫小鼠血清中检测到较高的抗体水平,免疫小鼠的脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后产生了明显的T细胞增殖反应并分泌产生了IFN-γ和IL-4。结论:重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠后能够产生特异性的抗体反应和细胞免疫反应。制备的重组PA4复制子病毒颗粒极有潜力作为人用炭疽候选疫苗,为进一步研究新型炭疽疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 保护性抗原第四结构域 炭疽毒素 复制子 重组病毒颗粒 免疫原性
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携带IFN—β基因的丙型肝炎病毒微型基因组构建及抑制病毒复制的效应 预览
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作者 杨敬 雷迎峰 +6 位作者 尹文 吕欣 陈任安 安群星 姚敏 贾战生 徐志凯 《临床肝胆病杂志》 CAS 2011年第1期57-60,共4页
目的构建丙型肝炎病毒(HCV)反应性干扰素(IFN)-β的微型基因组及其抑制效应的初步评价。方法提取poly I:C刺激的淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增IFN-β基因,克隆入前期构建的HCV微型基因组pT7-5U△131-315rI3Urz;PCR并鉴定插入方向,将反... 目的构建丙型肝炎病毒(HCV)反应性干扰素(IFN)-β的微型基因组及其抑制效应的初步评价。方法提取poly I:C刺激的淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增IFN-β基因,克隆入前期构建的HCV微型基因组pT7-5U△131-315rI3Urz;PCR并鉴定插入方向,将反向插入的质粒命名为pT7-5U△131-315rIFNI3Urz。将微型基因组5U△131-315rIFNI3URz克隆入pcDNA3.1载体,获得pCMV-5U△131-315rIFNI3URz。将体外转录的5U△131-315rIFNI3URz RNA转染Huh7.5BB7细胞,48 h后检测IFN-β的表达。将pCMV-5U△131-315rIFNI3URz转染Huh7.5 JFH-1细胞系,荧光实时定量PCR法测定细胞中HCV RNA。结果成功建立了Huh7.5JFH-1细胞系;含有IFN-β的微型基因组在复制子细胞和HCV感染细胞中可以特异表达IFN-β;携带IFN-β的HCV微型基因组可以降低细胞中病毒的RNA拷贝水平,具有一定的剂量依赖效应。结论反向插入IFN-β基因的HCV微型基因组进入HCV感染细胞内表达IFN-β并靶向抑制病毒的复制,为抗HCV感染研究提供了一个新的方法和思路。 展开更多
关键词 肝炎病毒属 基因组 病毒 干扰素Β 复制子
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