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ST8Sia1基因过表达载体构建与鉴定及对人黑色素瘤细胞增殖的影响 预览
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作者 刘金宜 富炜琦 +2 位作者 杜冠华 王金华 杨淬 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期733-739,共7页
目的构建ST8Sia1基因过表达载体,建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,检测ST8Sia1的表达及对细胞增殖的影响。方法通过PCR反应扩增ST8Sia1基因片段,双酶切目的基因片段和pEGFP-C1 载体以及pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro载体,分... 目的构建ST8Sia1基因过表达载体,建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,检测ST8Sia1的表达及对细胞增殖的影响。方法通过PCR反应扩增ST8Sia1基因片段,双酶切目的基因片段和pEGFP-C1 载体以及pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro载体,分别将目的基因片段和不同载体连接,得到ST8Sia1-pEGFP-C1重组载体和重组慢病毒载体。采用PCR方法和DNA序列进行鉴定。分别用不同载体转染黑色素瘤细胞WM451,筛选建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,Real-time PCR检测稳转细胞ST8Sia1 mRNA水平;Western blot法检测稳转细胞中ST8Sia1蛋白表达水平;CCK-8法检测稳转细胞的生长增殖活性;软琼脂克隆形成实验分析稳转细胞的克隆形成能力。结果成功构建ST8Sia1-pEGFP-C1重组质粒及ST8Sia1过表达慢病毒载体。发现ST8Sia1过表达慢病毒载体转染效率较高,建立稳定过表达ST8Sia1的WM451细胞株,发现ST8Sia1过表达促进肿瘤细胞增殖和克隆形成。结论成功构建了ST8Sia1过表达载体,并发现ST8Sia1过表达能够促进黑色素瘤细胞WM451的增殖、克隆形成能力。 展开更多
关键词 ST8Sia1 黑色素瘤 重组质粒 过表达载体 稳转细胞株 细胞增殖
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PTEN shRNA慢病毒载体构建及转染人子宫腺肌病细胞的稳定细胞株筛选
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作者 郭宇丹 曾玉燕 +1 位作者 姜心禅 李坤寅 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期990-995,共6页
目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(ade... 目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(adenomyosis,AM)细胞后筛选最优稳转株。方法设计合成3条特异性针对人PTEN基因的shRNA序列,构建到pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体中,测序鉴定载体构建情况,进而包装病毒并检测滴度。筛选出最优感染复数(multiplicity of infection,MOI)、嘌呤霉素杀灭浓度后,用慢病毒液转染AM细胞,以嘌呤霉素药筛建立PTEN敲低的稳定细胞株,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后细胞内PTEN mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测PTEN蛋白表达水平,以检验转染效率并筛选出干扰效率最佳的shRNA序列。结果成功构建了3个PTEN shRNA慢病毒载体,包装后以MOI为50转染AM细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达明显,嘌呤霉素持续药筛建立了PTEN敲低的稳定细胞株,以PTEN shRNA3慢病毒载体的干扰效率最佳(92.98%)。结论成功构建了PTEN shRNA慢病毒载体,并在体外有效转染了AM细胞,建立了PTEN敲低的稳定细胞株。 展开更多
关键词 子宫腺肌病 慢病毒 PTEN SHRNA 稳定细胞株
利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株 预览
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作者 覃鸿妮 谢钰珍 +1 位作者 马傲 蔡一林 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期741-750,共10页
【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子... 【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。 展开更多
关键词 CRISPR/Cpf1 ABCG1 ABCG4 基因敲除 稳定细胞株
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稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析 预览
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作者 武乐祎 吴素芳 +4 位作者 车影 张强 李鹏 卞广林 王选年 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1056-1063,共8页
建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到... 建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10^6个·mL^-1,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370mg·L^-1;利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。 展开更多
关键词 CHO-K1 PCV2-Cap 稳转细胞系 免疫原性
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人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定 预览
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作者 陈惠莹 毛莹莹 +3 位作者 裴娜娜 颜仁和 万鹏飞 李红卫 《暨南大学学报:自然科学与医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期187-194,共8页
目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-h... 目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系. 展开更多
关键词 hAT2R Compound21 慢病毒 稳定细胞系 前列腺癌
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可诱导表达hFGFR1α稳定细胞系的建立与表达优化 预览
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作者 朱先玉 王历 +3 位作者 杨茂 吴婷 何涛 杨文理 《西南医科大学学报》 2019年第3期215-218,共4页
目的:构建hFGFR1α(human fibroblast growth factor receptor 1 alpha, hFGFRα)稳定细胞系,优化获得最适诱导表达条件,实现可诱导的、高效的稳定表达。方法:将hFGFR1α基因编码区全长克隆入pcDNA5/FRT/TO/2 × Flag表达载体,连同p... 目的:构建hFGFR1α(human fibroblast growth factor receptor 1 alpha, hFGFRα)稳定细胞系,优化获得最适诱导表达条件,实现可诱导的、高效的稳定表达。方法:将hFGFR1α基因编码区全长克隆入pcDNA5/FRT/TO/2 × Flag表达载体,连同pOG44重组酶质粒共转染人宿主细胞Flp-InTM-T-RexTM-293细胞系(HEK293H),潮霉素B筛选获得阳性克隆细胞系HEK293H/hFGFR1ɑ。用不同浓度强力霉素(doxycline, Dox)或者不同作用时间对HEK293H/hFGFR1ɑ细胞系进行诱导表达,Western Blot鉴定hFGFR1ɑ蛋白的表达情况。结果:构建了pcDNA5-FRT/TO/2 × Flag/hFGFR1ɑ重组表达载体,获得了可被Dox诱导表达的HEK293H/hFGFR1ɑ稳定细胞系;0.001μg/mL Dox即可诱导hFGFR1ɑ蛋白表达,0.01μg/mL Dox即可诱导表达量达峰值;Dox对该细胞系作用2 h即诱导hFGFR1ɑ蛋白表达,对其作用24 h后该细胞系的表达明显增强。结论:成功构建了可诱导的、高效的稳定表达细胞系HEK293H/hFGFR1ɑ;Dox诱导该细胞系表达具有剂量差异性和时间依赖性。 展开更多
关键词 FGFR1 稳定细胞系 蛋白质表达 Doxycline 诱导
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中国荷斯坦奶牛MD-2基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建
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作者 焦寒伟 赵宇 +4 位作者 帅学宏 伍莉 陈吉轩 王红均 黄庆洲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期493-498,共6页
将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和... 将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和Western-blot分别检测融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选,获取稳定细胞系。结果发现,目的基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码160个氨基酸。双酶切鉴定和测序结果均表明,MD-2基因编码区正确插入pEGFP-N1真核表达载体,读码框架正确,MD-2-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中,能够成功表达;极限稀释获取单细胞,用250?g/mL的G418筛选得到的细胞系,经流式细胞术和Western-blot检测,在pMD-2-EGFP稳定细胞系组,分子质量约为46 ku处,发现了特异性条带,而pEGFP-N1空载稳定细胞组,以及空白的HEK293细胞对照组,均未发现条带。综上所述,本研究成功构建了真核表达载体pMD-2-EGFP,并在HEK293细胞中能够成功表达;经极限稀释,并利用G418抗性筛选,成功获得了pMD-2-EGFP和pEGFP-N1稳定细胞系,这为进一步研究中国荷斯坦奶牛奶牛MD-2基因的生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 中国荷斯坦奶牛 髓样分化蛋白-2 EGFP 真核表达 稳定细胞系
质粒介导LAPTM4B过表达胰腺癌细胞株PANC-1的构建及鉴定 预览
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作者 张光涛 梁悦 李明华 《岭南现代临床外科》 2019年第1期44-47,共4页
目的筛选低表达LAPTM4B-35 细胞株并构建质粒介导的LAPTM4B 过表达胰腺癌细胞株并进行鉴定。方法通过RT-PCR 及Western-Blot 方法检测3 种胰腺癌细胞LAPTM4B 的表达,筛选出现低表达LAPTM4B细胞株。通过质粒稳定转染胰腺癌细胞PANC-1,pcD... 目的筛选低表达LAPTM4B-35 细胞株并构建质粒介导的LAPTM4B 过表达胰腺癌细胞株并进行鉴定。方法通过RT-PCR 及Western-Blot 方法检测3 种胰腺癌细胞LAPTM4B 的表达,筛选出现低表达LAPTM4B细胞株。通过质粒稳定转染胰腺癌细胞PANC-1,pcDNA3.0-AE过表达LAPTM4B基因,应用RT-PCR,Western-blot进行鉴定。结果成功扩增提取pcDNA3.0-AE质粒,转染并筛选稳定细胞株。RT-PCR 及Western-Blot 显示相对空白对照,稳定株的过表达LAPTM4B-35明显。结论成功构建筛选低表达细胞株,并建立稳定过表达LAPTM4B的胰腺癌细胞株。 展开更多
关键词 LAPTM4B PANC-1 质粒 稳定株 胰腺癌
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可调控表达人博卡病毒1型非结构蛋白NS1稳定细胞系的建立及其反式转录激活作用初探
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作者 朱记平 刘媛 +2 位作者 骆茹梦 冯小婷 李毅 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1126-1134,共9页
人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构... 人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构蛋白NS1的稳定细胞系。构建NS1重组慢病毒质粒(含可调控启动子),应用转染试剂将NS1重组慢病毒质粒转染至HEK293T细胞。通过嘌呤霉素筛选抗性细胞、多西环素诱导NS1表达,建立可稳定表达NS1-100、NS1-70蛋白的HEK 293T细胞系,利用荧光标记蛋白和Western blotting检测,确定NS1蛋白的表达。并在稳定表达NS1细胞系中转染HBoV1启动子-荧光素酶基因的质粒,分析NS1的反式转录激活活性。结果表明NS1蛋白可在建立的细胞系中稳定表达,且稳定表达NS1蛋白对HBoV1启动子有较强的激活活性,为进一步研究非结构蛋白NS1的功能及人博卡病毒致病机理奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 人博卡病毒1型 NS1 稳定表达细胞系 反式转录激活
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶稳定敲低对肾透明细胞癌细胞迁移的抑制作用 预览
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作者 白宏刚 张巧 +4 位作者 况应敏 杨哲 韩巧巧 王艳玲 朱月春 《医学研究生学报》 北大核心 2018年第7期697-702,共6页
目的肾透明细胞癌(ccRCC)是一种代谢性疾病,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与ccRCC的发生发展及患者的不良预后呈正相关。文章首次构建了G6PD缺陷型ccRCC稳定细胞株,检测其迁移表型。方法 Oligo Engine RNAi设计针对人G6PD基因3'端非... 目的肾透明细胞癌(ccRCC)是一种代谢性疾病,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与ccRCC的发生发展及患者的不良预后呈正相关。文章首次构建了G6PD缺陷型ccRCC稳定细胞株,检测其迁移表型。方法 Oligo Engine RNAi设计针对人G6PD基因3'端非编码区的siRNA及无关siRNA序列,合成双链后通过BglⅡ和HindⅢ酶切位点插入p SP-GFP/Neo表达载体,构建Caki-1-G6PD siRNA细胞株及Caki-1-Negative control细胞株,进而转染并经G418筛选。应用Real-time RT-PCR、Western blot及酶活性方法,检测细胞株的G6PD表达和酶活性;Transwell方法检测细胞迁移表型、Western blot检测p-STAT3/STAT3表达。结果荧光显微镜下可见Caki-1-G6PD siRNA细胞与Caki-1-Negative control细胞形态良好,通过GFP表达量计算细胞转染效率约为45%-55%;48 h后细胞贴壁密度达90%,荧光表达略有增强,转染效率可达60%。光镜和荧光显微镜下亦可见细胞状态良好,GFP阳性率达95%。与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-G6PD siRNA细胞的G6PD mRNA表达量蛋白表达量和酶活性均显著降低(P〈0.05)。与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-G6PD siRNA迁移细胞的相对数量明显降低[(64.0±4.2)个vs(30.0±2.9)个,P〈0.01],p-STAT3/STAT3值亦明显下降[(0.45±0.05)vs(0.24±0.01),P〈0.01]。结论文章首次成功构建了G6PD稳定敲低和迁移能力低下的Caki-1细胞系,其G6PD敲低所致ccRCC细胞迁移能力降低与STAT3信号相关。 展开更多
关键词 G6PD 肾透明细胞癌 稳定细胞株
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稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系的构建 预览
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作者 雷蕾 黄珊 +6 位作者 于明航 刘志强 刘师伟 李婷 赵秀娟 李泽兴 王玺 《天津医药》 CAS 北大核心 2018年第4期341-344,共4页
目的构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)。方法采用pCDH-CMV-GFPLC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系。通过Westernblo... 目的构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)。方法采用pCDH-CMV-GFPLC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系。通过Westernblot和流式细胞术检测THP-1细胞中GFP-LC3蛋白的表达,并利用该稳定表达细胞系观察饥饿和雷帕霉素诱导时细胞发生的自噬变化。结果筛选得到稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光。Westernblot和流式细胞术检测证实了GFP-LC3融合蛋白的表达。激光共聚焦法和Westernblot均证实饥饿和雷帕霉素可以诱导自噬的发生,且GFP-LC3融合蛋白可以反映内源LC3蛋白的变化,包括蛋白聚集和发生剪切修饰。结论应用慢病毒质粒系统成功构建了高效稳定表达GFPLC3蛋白的THP-1细胞系,从而为后续利用GFP-LC3融合蛋白研究自噬变化提供了细胞模型。 展开更多
关键词 自噬 GFP-LC3 THP-1细胞 稳定细胞系 雷帕霉素
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慢病毒介导N2ICD过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株的构建及鉴定
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作者 吴丹琳 温俊杰 +9 位作者 叶健斌 薛杨 林彦青 胡冰心 罗美群 陈中标 谢金玲 宁立军 宁云山 李妍 《生物技术》 2018年第4期372-376,共5页
[目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定... [目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定后,三质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,收集且浓缩病毒毒液用于感染人胃癌MKN45细胞并筛选稳定细胞株,用Western Blot验证。[结果]成功构建慢病毒重组质粒N2ICD/pLV;包装病毒后,荧光显微镜下观察到大部分HEK293T细胞发出绿色荧光;收集病毒毒液感染MKN45细胞,显微镜下观察有部分细胞表达绿色荧光蛋白;流式分选技术筛选得到稳定细胞株,Western Blot鉴定结果显示:相比于空白对照组,稳定株的N2ICD过表达明显。[结论]成功构建慢病毒表达质粒N2ICD/pLV,并建立稳定过表达N2ICD的胃癌细胞株N2ICD/pLV-MKN45。 展开更多
关键词 NOTCH2 N2ICD 慢病毒 稳定株
H5N1型禽流感NS1基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建 被引量:1
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作者 王红均 张其彬 +5 位作者 伍莉 陈吉轩 帅学宏 丁孟建 黄庆洲 焦寒伟 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期2125-2130,共6页
将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜... 将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜、FCM和Western blot 3种方法检测NS1-EGFP融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选获取稳定细胞系。结果显示,NS1基因正确插入pEGFP-N1真核表达载体,NS1-EGFP融合蛋白读码框架正确;3种检测方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中能够表达;pEGFP-N1和NS1-EGFP稳定细胞系流式细胞仪检测,阳性率分别为95.74%和96.10%,Western blot检测结果发现,HEK293空白细胞和pEGFP-N1稳定细胞系未见任何条带,NS1-EGFP稳定细胞系在51 000处见特异性条带,综上说明稳定细胞系构建成功。本试验为进一步深入研究禽流感病毒NS1基因的生物学功能作铺垫。 展开更多
关键词 H5N1型禽流感病毒 非结构蛋白1 EGFP 融合蛋白 真核表达 稳定细胞系
HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立 预览
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作者 李苗苗 杨霄旭 +2 位作者 杨朝霞 向双林 韩梅 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2017年第1期31-36,共6页
为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过W... 为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过Western Blot技术检测Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480细胞系,采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后,通过RT-PCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平,经长达60 d的传代,最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系,为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型. 展开更多
关键词 Nef基因 SW480细胞 G418 稳定细胞系
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利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株 被引量:1
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作者 常丽贤 孙聪聪 +5 位作者 陈晓娟 杨文钰 张家源 张英弛 袁卫平 竺晓凡 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期284-293,共10页
基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连... 基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连接形成DNAH2 sg RNA-A、B双链,再分别与带有BbsⅠ粘性末端的p X462线性载体相连,形成p X462-DNAH2-A、p X462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后,加入嘌呤霉素,以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株,再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达,最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sg RNA双链成功插入p X462载体,U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达,DNAH2基因发生移码突变,从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株,为研究DNAH2基因提供有利工具。 展开更多
关键词 DNAH2 CRISPR/Cas9n 基因敲除 稳定细胞株
猪GM—CSF稳定表达细胞系的建立 预览
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作者 李俊敏 雍艳红 +4 位作者 巩栋梁 冯园 韦璇 何玉林 巨向红 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期963-970,共8页
旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、... 旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、牛、狗和人的同源性分别为77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。通过EcoR I和BamH I酶切后,将GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP载体中,构建出pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,G418筛选阳性细胞。在转染后24h,荧光定量PCR可见GM-CSF mRNA表达量较对照组及空载体组细胞显著升高(P〈0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在含有G418的培养液中连续传代30次,仍可见GM-CSF基因和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-pGM-CSF和能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。 展开更多
关键词 GM -CSF 真核表达 稳定细胞系
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猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立 预览
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作者 唐青海 杨海 +4 位作者 黎露 陈果亮 何丽芳 刘最 王芳宇 《中国畜牧兽医》 北大核心 2017年第8期2261-2268,共8页
本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,... 本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞,经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测N蛋白的表达。结果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323bp,原核表达重组N蛋白分子质量约60ku,其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应,荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 CH-HuN1301毒株 N基因 稳定细胞系
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可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化 预览
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作者 毛亮 程俊 +4 位作者 黄文俊 谭晓秋 党喜同 曾晓荣 杨艳 《四川生理科学杂志》 2017年第2期55-58,共4页
目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化。方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,... 目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化。方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系。BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BK_(Ca)蛋白质进行纯化。用western blot检测BK_(Ca)通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性。结果:BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BK_(Ca)-FLAG融合蛋白,BK_(Ca)通道电导值为213.39±9.52pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61pS(n=13,inside-out),BK_(Ca)通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)通道具有相同的特征。纯化后的BK_(Ca)蛋白质条带单一,纯度约为89%。结论:成功构建BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BK_(Ca)蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础。 展开更多
关键词 稳定表达细胞系 BKCa重组蛋白质 膜片钳
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高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响 预览 被引量:1
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作者 曹小年 胡发涌 +3 位作者 杨熹 来森艳 孙威 胡俊波 《华中科技大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期128-131,共4页
目的构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携... 目的构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携带p55PIK基因的pcDNA3.1质粒转染LoVo细胞,加入适量的G418筛选(500μg/mL),并通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测p55PIK mRNA水平和蛋白水平,进一步通过BrdU/PI掺入法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响。结果成功构建了p55PIK高表达的质粒,并筛选出稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系;在LoVo细胞中高表达p55PIK能够促进细胞S期的进程和DNA的合成。结论成功构建了pcDNA3.1-p55PIK质粒,并筛选出p55PIK稳定高表达的LoVo细胞系,高表达p55PIK能够促进LoVo细胞S期的进程和DNA的合成。 展开更多
关键词 p55PIK 稳定细胞系 LOVO细胞 细胞周期 DNA合成
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人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选 预览 被引量:2
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作者 刘凯玉 蒋维 +2 位作者 王瑞娜 吴家雪 党永军 《生物学杂志》 CAS CSCD 2016年第3期1-4,共4页
构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体,筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SUDHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物,用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-c GFP-CARABIN,将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的... 构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体,筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SUDHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物,用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-c GFP-CARABIN,将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent共转染HEK293T细胞制备病毒,用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后,用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞,Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-c GFP-CARABIN慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后,荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%,筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到CARABINGFP融合蛋白表达。成功构建了Carabin过表达慢病毒载体并筛选出了CARABIN-GFP稳定表达的细胞株。 展开更多
关键词 CARABIN 过表达 稳定细胞株 弥散性大B淋巴瘤
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