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江苏某牛场生牛乳中肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的分离鉴定、耐药性和毒力分析
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作者 葛东红 周明旭 +3 位作者 朱纯 鲍熹 卢宇 张雪寒 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1140-1144,1162共6页
肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌均是重要的条件致病菌,其具备的多重耐药性是造成医院内感染并难以治愈的主要原因。本试验从江苏某奶牛场隐性乳房炎奶牛的生牛乳样品中分离到3株肺炎克雷伯菌及4株鲍曼不动杆菌,通过耐药性检测发现其中部分... 肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌均是重要的条件致病菌,其具备的多重耐药性是造成医院内感染并难以治愈的主要原因。本试验从江苏某奶牛场隐性乳房炎奶牛的生牛乳样品中分离到3株肺炎克雷伯菌及4株鲍曼不动杆菌,通过耐药性检测发现其中部分菌株具有对万古霉素、克林霉素、头孢唑啉和呋喃妥因等抗生素的多重耐药性;小鼠毒力试验表明分离菌株具备较强的毒力。本试验为奶牛场预防和治疗该类病原感染提供参考依据,同时对耐药菌株可能引起的公共卫生安全问题提出警示。 展开更多
关键词 奶牛乳房炎 肺炎克雷伯菌 鲍曼不动杆菌 耐药性 毒力
猪支原体肺炎活疫苗(168株)气溶胶免疫后呼吸道sIgA分泌及抗原存留规律 预览
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作者 华利忠 白昀 +6 位作者 武昱孜 王佳 杨浩 吴猛 袁厅 邵国青 冯志新 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第4期69-74,共6页
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae ,Mhp)引起的猪的一种慢性呼吸道疾病,严重影响养猪业发展,活疫苗气溶胶免疫是防治该病的新措施。为研究猪肺炎支原体活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,疫苗株在免疫猪肺内的占位存... 猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae ,Mhp)引起的猪的一种慢性呼吸道疾病,严重影响养猪业发展,活疫苗气溶胶免疫是防治该病的新措施。为研究猪肺炎支原体活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,疫苗株在免疫猪肺内的占位存留规律,选用3周龄不吃初乳猪27头,随机分为3组,G1气溶胶免疫组12头,G2肺内免疫组12头,同时设立阴性对照3头。分别于免疫后第2 h、7 d、14 d及28 d进行鼻拭子Mhp sIgA检测以及血清抗体检测。另外在上述时间点分别宰杀G1和G2组各3头,对照组在实验组免疫后第28 d宰杀,采集肺泡灌洗液,分别进行Mhp sIgA检测及Mhp疫苗株含量检测。结果显示:(1)所有试验猪至实验结束,Mhp血清抗体未出现转阳现象;(2)鼻拭子sIgA水平G1组在免疫后第14 d与对照组相比上升,差异具有显著统计学意义(p <0.05);G2组在免疫后第7 d和14 d与相应的对照组相比上升,差异具有显著统计学意义(p <0.05),各时间点G1组与G2组sIgA水平差异不具备统计学意义(p >0.05);(3)G1组肺泡灌洗液中的 sIgA在免疫后14 d部分转阳(阳性率33.33%),28 d全部转阳(阳性率100%);G2组在免疫14 d时已全部转阳(阳性率100%),各时间点G1组与G2组sIgA水平差异不具备统计学意义(p >0.05);(4)气溶胶免疫组肺泡灌洗液内Mhp疫苗株浓度在免疫后第2 h、7 d、14 d和28 d分别是相应肺内免疫组的0.37倍、1.01倍、0.88倍以及0.52倍。猪支原体肺炎活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,和肺内免疫一样可以诱导免疫猪的局部黏膜免疫以及具有同等的占位效应,且经气溶胶免疫的疫苗株在免疫仔猪体内的增殖水平可能与其诱导的黏膜免疫水平相关。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体活疫苗(168株) 气溶胶免疫 肺内免疫 占位效应 黏膜免疫
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重组蛋白CTB-P97R1对猪支原体肺炎活疫苗滴鼻免疫效果的评价 预览
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作者 韦艳娜 张珍珍 +5 位作者 王丽 王佳 陈蓉 冯志新 邵国青 熊祺琰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期74-79,共6页
为提高滴鼻免疫条件下猪支原体肺炎活疫苗的免疫效果,本研究设计引物扩增猪肺炎支原体P97R1基因,融合至霍乱毒素B亚单位(CTB)基因下游,构建了重组质粒p ET-CTB-P97R1。重组菌经IPTG诱导表达、分离纯化得到r CTB-P97R1重组蛋白。利用体... 为提高滴鼻免疫条件下猪支原体肺炎活疫苗的免疫效果,本研究设计引物扩增猪肺炎支原体P97R1基因,融合至霍乱毒素B亚单位(CTB)基因下游,构建了重组质粒p ET-CTB-P97R1。重组菌经IPTG诱导表达、分离纯化得到r CTB-P97R1重组蛋白。利用体外神经节苷脂(GM1)结合试验检测r CTB-P97R1的佐剂活性。随后将r CTB-P97R1与活疫苗混合后滴鼻免疫小鼠,免疫后采血和收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),分别检测其中的特异性Ig G抗体和s Ig A抗体的水平评价免疫效果。结果显示,r CTB-P97R1可以特异性结合GM1,具有生物学活性。小鼠免疫后的血清Ig G抗体显著高于活疫苗对照组(p<0.01),同时产生了高水平的P97R1特异性Ig G抗体(p<0.01);小鼠BALF中的s Ig A抗体也显著高于活疫苗对照组(p<0.05)。结果表明,r CTB-P97R1能够显著增强经滴鼻免疫的猪支原体肺炎活疫苗的免疫效力,同时可提升P97R1的免疫应答,有望作为经黏膜免疫的猪支原体肺炎活疫苗的新型佐剂。 展开更多
关键词 霍乱毒素B亚单位 P97R1 佐剂 滴鼻 猪支原体肺炎活疫苗
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慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定 被引量:1
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作者 钟纯燕 主性 +6 位作者 李基棕 毛立 李文良 郝飞 刘茂军 嵇辛勤 肖芳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期50-57,共8页
拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础。本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴... 拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础。本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴定及测序正确,再克隆于pCDH-CMVMCS-EF1-Puro载体,构建含bta-miR-222基因的miRNA慢病毒重组质粒pCDH-miR-222-GFP。将pCDHmiR-222-GFP与两个包装质粒PSP、PMD共转染293T细胞,制备含bta-miR-222基因的重组慢病毒VPCDH+miR-222。用制备成功的慢病毒VPCDH+miR-222感染MDBK细胞,经Puromycin嘌呤霉素筛选,荧光显微镜观察感染效率。结果显示,pCDH-miR-222-GFP过表达质粒构建成功,序列比对符合率达100%。将pCDH-miR-222-GFP、PSP和PMD共转染后,通过荧光显微镜观察到293T细胞分布大量的荧光,说明成功构建了重组慢病毒VPCDH+miR-222,经Puromycin嘌呤霉素筛选10代后,VPCDH+miR-222在MDBK细胞中仍具有感染效率。本研究成功获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为进一步研究bta-miR-222在病毒感染MDBK细胞中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 bta-miR-222 MDBK细胞 慢病毒
以史为鉴,浅谈中国非洲猪瘟的防控与净化 预览 被引量:4
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作者 华利忠 冯志新 +4 位作者 张永强 郝飞 戈胜强 王佳 邵国青 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第2期96-104,共9页
自2018年8月中国首例非洲猪瘟案例以来,短短数月,已蔓延了十几个省份,给我国养猪业造成了巨大的损失,形势异常严峻。如何控制甚至净化非洲猪瘟疫情以及如何防止非洲猪瘟跨境传入(或再次跨境传入)已成为整个产业急需解决的重大问题。由... 自2018年8月中国首例非洲猪瘟案例以来,短短数月,已蔓延了十几个省份,给我国养猪业造成了巨大的损失,形势异常严峻。如何控制甚至净化非洲猪瘟疫情以及如何防止非洲猪瘟跨境传入(或再次跨境传入)已成为整个产业急需解决的重大问题。由于国内尚缺乏防控非洲猪瘟的经验,本文从国外防控非洲猪瘟成败的关键风险因素出发,描述了非洲猪瘟的传播途径,分析了西欧防控非洲猪瘟入境的主要措施,探讨了撒丁岛和俄罗斯控制失败的因素,总结了西班牙和巴西成功净化的关键措施,最后根据上述相关因素分析了我国在控制和净化非洲猪瘟的优势条件和风险因素,针对各风险因素提出了我国控制非洲猪瘟的优化控制措施,并提出了我国地方品种猪资源保护的建议,为我国非洲猪瘟的防控提供理论基础和实践经验。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 中国 净化 风险因素 防控策略
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猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用 预览 被引量:3
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作者 肖琦 茅爱华 +13 位作者 汪伟 俞正玉 郭佳慧 袁万哲 赵攀登 温立斌 范宝超 李彬 朱雪蛟 胡屹屹 郭容利 曲梦 杨倩 何孔旺 《中国动物传染病学报》 北大核心 2018年第2期9-14,共6页
根据GenBank登录的猪圆环病毒3型(porcinecircovirustype3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932bp;最低的质粒检测浓度为10copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、... 根据GenBank登录的猪圆环病毒3型(porcinecircovirustype3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932bp;最低的质粒检测浓度为10copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。 展开更多
关键词 圆环病毒3型 PCR 临床应用
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犬干扰素α2的原核表达及抗病毒活性分析 预览 被引量:1
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作者 姚凌云 王晶宇 +8 位作者 欧阳伟 钱晶 吴世妍 夏兴霞 诸玉梅 王晓丽 潘群兴 芮荣 王永山 《中国动物传染病学报》 北大核心 2018年第2期59-63,共5页
本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-CaIFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定,分子量约为23kDa的目的蛋... 本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-CaIFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定,分子量约为23kDa的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组CaIFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/mL。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。 展开更多
关键词 重组犬干扰素α2 原核表达系统 抗病毒活性
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gga-miR-142-5p负调控chMDA5抗传染性法氏囊病病毒感染的分子机制 预览 被引量:1
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作者 欧阳伟 潘群兴 +5 位作者 钱晶 王晶宇 王晓丽 夏兴霞 诸玉梅 王永山 《中国动物传染病学报》 北大核心 2018年第6期24-33,共10页
传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseasevirus,IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。chMDA5在识别病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern,PAMPs)及激活宿... 传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseasevirus,IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。chMDA5在识别病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern,PAMPs)及激活宿主的天然免疫应答中具有重要的作用,但chMDA5识别IBDV的分子机制仍然不清楚。本研究用IBDV感染DT40细胞,在IBDV感染的DT40细胞中,chMDA5的表达水平显著升高。chMDA5过表达可以抑制IBDV的复制,并激活IFN-βpromoter和Mxpromoter活性,chMDA5抑制表达则得到相反的结果;chMDA5激活IFN-βpromoter活性主要是通过IRF7通路。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-142-5p可作用于chMDA5的3'UTR;qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-142-5p可以使chMDA5的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-142-5p可依赖IRF7通路使IFN-βpromoter和Mxpromoter活性降低,IBDV复制水平升高。本研究表明,gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR负调控chMDA5的表达从而影响其下游IFN-βpromoter和Mxpromoter活性来发挥抗IBDV感染的作用。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 gga-miR-142-5p chMDA5 天然免疫
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GEL 01佐剂联合猪支原体肺炎活疫苗黏膜接种的效果评估 预览
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作者 张珍珍 韦艳娜 +4 位作者 王佳 王海燕 熊祺琰 邵国青 冯志新 《中国动物传染病学报》 北大核心 2018年第6期73-79,共7页
为评估水性佐剂GEL01对猪支原体肺炎活疫苗的黏膜接种效果的影响,本研究以小鼠为动物模型,将猪肺炎支原体(168株)活疫苗与水性佐剂GEL01滴鼻免疫小鼠,于免疫后不同时间点收集血清和支气管肺泡灌洗液,检测其中抗原特异性抗体水平和相关... 为评估水性佐剂GEL01对猪支原体肺炎活疫苗的黏膜接种效果的影响,本研究以小鼠为动物模型,将猪肺炎支原体(168株)活疫苗与水性佐剂GEL01滴鼻免疫小鼠,于免疫后不同时间点收集血清和支气管肺泡灌洗液,检测其中抗原特异性抗体水平和相关细胞因子的分泌情况,并检测了GEL01对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果显示Gel01联合活疫苗黏膜接种后,支气管肺泡灌洗液中抗原特性抗体(IgG、IgG1、IgG2a和sIgA)的水平显著高于单独疫苗组,同时支气管肺泡灌洗液中Th1(IFN-γ)型、Th2(IL-4)型和Th17(IL-17)型细胞因子分泌显著增加;另外,GEL01联合猪肺炎支原体活疫苗黏膜接种后,促进小鼠淋巴细胞的显著增殖,并同时上调血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平。以上结果说明GEL01作为黏膜佐剂配合猪支原体肺炎活疫苗使用时,可全面激活宿主免疫系统,尤其是与猪肺炎支原体感染免疫保护相关的呼吸道局部黏膜免疫和全身循环系统的细胞免疫。 展开更多
关键词 佐剂 GEL01 黏膜 猪支原体肺炎 活疫苗
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抗病毒蛋白Viperin抑制猪瘟病毒在PK-15细胞上的复制 预览
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作者 李文良 毛立 +5 位作者 邓加武 郝飞 李基棕 杨蕾蕾 张纹纹 江杰元 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期139-146,共8页
Viperin是一种抗病毒蛋白,具有广谱的抗病毒功能。为了研究猪源抗病毒蛋白Viperin对猪瘟病毒(CSFV)的抗病毒作用及机制,通过构建细胞系过表达或通过siRNA转染抑制Viperin表达,采用荧光定量RTPCR和病毒滴度测定检测CSFV增殖水平的变化... Viperin是一种抗病毒蛋白,具有广谱的抗病毒功能。为了研究猪源抗病毒蛋白Viperin对猪瘟病毒(CSFV)的抗病毒作用及机制,通过构建细胞系过表达或通过siRNA转染抑制Viperin表达,采用荧光定量RTPCR和病毒滴度测定检测CSFV增殖水平的变化;检测培养上清和细胞中病毒含量的变化趋势,评价其对病毒释放的影响;进而通过共聚焦试验和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验检测Viperin与病毒E2蛋白的共定位与相互作用。与对照细胞相比,过表达Viperin蛋白可以显著抑制CSFV在PK-15细胞上的复制,在感染后24、48、72h,病毒基因水平和病毒滴度分别下降68.75%、83.61%、77.27%和68.75%、87.5%、80.39%。通过RNA干扰技术抑制Viperin在PK-Vi细胞中的表达后CSFV复制显著恢复(仍低于对照组)。培养上清和细胞中病毒含量均同等程度受到抑制,表明Viperin表达对病毒的释放没有影响。共聚焦试验证明Viperin蛋白与E2蛋白在细胞内存在共定位现象。免疫共沉淀试验证明Viperin蛋白与E2蛋白存在相互作用。该研究证实Viperin具有抗CSFV作用,该作用可能是通过与病毒E2蛋白相互作用实现的,这为CSFV与宿主免疫反应相互作用研究提供了理论基础。 展开更多
关键词 Viperin 猪瘟病毒 抗病毒 共定位 相互作用
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猪流感H3N2型病毒特异性sIgA抗体分泌规律研究 预览 被引量:2
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作者 白昀 舒采松 +5 位作者 甘源 倪博 华利忠 吴猛 邵国青 冯志新 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2017年第11期956-961,共6页
目的 研究不同品种猪应答猪流感病毒感染,呼吸道分泌特异性sIgA抗体的分泌规律,以及针对不同抗原蛋白sIgA抗体的分泌差异。方法 将猪流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)滴鼻感染试验猪(1×107 TCID50/mL,2mL/头),采集感染后... 目的 研究不同品种猪应答猪流感病毒感染,呼吸道分泌特异性sIgA抗体的分泌规律,以及针对不同抗原蛋白sIgA抗体的分泌差异。方法 将猪流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)滴鼻感染试验猪(1×107 TCID50/mL,2mL/头),采集感染后21d内不同时间点的鼻拭子样品,用M1、NS1和PB1三种重组蛋白分别建立的间接ELISA方法检测特异性sIgA抗体,并分析其分泌规律及差异。结果 显示针对3种重组蛋白的特异性sIgA抗体在整个检测周期内,分泌规律相似,差异无统计学意义,均表现为感染后第5d特异性sIgA抗体水平迅速升高,第14d达到高峰,随后开始逐渐下降。在不同品种猪之间,仅巴马猪分泌抗PB1蛋白的sIgA抗体在第14d和21d时高于二元猪(P〈0.05),而抗M1和抗NS1蛋白的sIgA抗体在两种品种猪之间无统计学差异(P〉0.05)。结论 初步探索了猪在感染猪流感病毒后特异性sIgA黏膜抗体的分泌规律,为进一步研究SIV黏膜抗体诊断试剂奠定基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒 间接ELISA sIgA抗体
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山羊副流感病毒3型N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 预览
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作者 王咪 李文良 +4 位作者 郝飞 毛立 杨蕾蕾 张纹纹 江杰元 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期150-156,共7页
山羊副流感病毒3型可引起山羊呼吸道疾病,与支原体、细菌等混合感染引起广泛的发病与死亡,笔者拟通过建立基于N蛋白的间接ELISA抗体检测方法用于该病的监测。设计引物扩增目的基因N,克隆到质粒pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a-N,并... 山羊副流感病毒3型可引起山羊呼吸道疾病,与支原体、细菌等混合感染引起广泛的发病与死亡,笔者拟通过建立基于N蛋白的间接ELISA抗体检测方法用于该病的监测。设计引物扩增目的基因N,克隆到质粒pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a-N,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组N蛋白并鉴定。通过条件优化建立ELISA抗体检测方法,并检测临床样品与HI试验进行比较。本试验成功构建重组质粒,诱导表达的蛋白质(47ku)经SDS-PAGE与Western blot鉴定,证明其正确表达且具有良好的抗原性与特异性。利用纯化的蛋白质作为包被抗原优化间接ELISA反应条件,确定其最佳抗原包被浓度为1μg·mL^-1、血清稀释度为1∶200、血清作用时间60min、酶标二抗工作浓度为1∶6 000、二抗反应时间30min、底物显色时间10min。通过对138份临床血清样品检测发现其与HI试验结果符合率达88.41%。本研究建立的间接ELISA检测方法敏感、特异、准确,适用于临床样品的检测与血清流行病学调查。 展开更多
关键词 山羊副流感病毒3型 N蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪Hokovirus LAMP检测方法的建立及应用 预览 被引量:2
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作者 李彬 杜露平 +4 位作者 何孔旺 孙冰 倪艳秀 温立斌 张雪寒 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第2期859-863,共5页
为提高猪Hokovirus(PHoV)检测的敏感性和简便性,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种敏感、特异、快速、简便、实用的检测PHoV的技术.针对PHoV VP1/2基因保守区设计4条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化并检测其敏... 为提高猪Hokovirus(PHoV)检测的敏感性和简便性,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种敏感、特异、快速、简便、实用的检测PHoV的技术.针对PHoV VP1/2基因保守区设计4条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化并检测其敏感性和特异性.结果表明,所建立的方法最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃,该方法具有良好的特异性,与其它常见动物病毒(PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、PPV、JEV)无交叉反应,对PHoV的最低检出量为10拷贝,其敏感性是PCR方法的10倍,且通过加入荧光染料可直接判定结果.研究表明,该方法特异性强、敏感性高,且操作简便、检测成本低、检测时间短,不需要特殊的仪器,本研究建立的LAMP方法可以作为PHoV在临床上的一种检测技术. 展开更多
关键词 猪Hokovirus 环介导等温扩增(LAMP) 检测方法
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犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达 被引量:1
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作者 李月华 王永山 +5 位作者 毕振威 夏兴霞 欧阳伟 刘华洁 贾红 姚火春 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期991-998,共8页
从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV—JSl2株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pHl0可使病毒失去感染性,56。C作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列... 从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV—JSl2株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pHl0可使病毒失去感染性,56。C作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV—JSl2为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.39/6~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV—JSl2株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV—jsl2与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western—blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。 展开更多
关键词 犬细小病毒 VP2基因 分子特征 病毒变异 原核表达 间接ELISA
PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR检测方法的建立及其应用 预览 被引量:12
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作者 郭容利 何孔旺 +5 位作者 倪艳秀 茅爱华 温立斌 李彬 王小敏 俞正玉 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期1065-1069,共5页
建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验.在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(P... 建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验.在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其他病毒无特异性条带.应用该方法对江苏省及周边地区154份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,结果表明:PEDV、TGEV、PARV阳性率分别为53.2%、8.4%、5.2%.PEDV与TGEV混合感染率为5.2%,PEDV与PARV混合感染率为4.5%.该方法的建立对临床上进行这3种疾病混合感染的检测具有重要意义. 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪A群猪轮状病毒 多重RT-PCR
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基于Arc GIS的江苏省猪粮比价风险等级评估 预览 被引量:1
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作者 郁达威 胡肄农 +1 位作者 谭业平 陆昌华 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第6期1478-1483,共6页
为建立猪粮比价评估系统,以江苏省宿迁市为例,分析猪粮比价与生猪价格、玉米价格和豆粕价格相关性,通过建立GM(1,1)模型,分别对生猪价格、玉米价格和豆粕价格进行趋势预测,采用灰色关联度建立猪粮比价与其影响因素的关系模型,利用地... 为建立猪粮比价评估系统,以江苏省宿迁市为例,分析猪粮比价与生猪价格、玉米价格和豆粕价格相关性,通过建立GM(1,1)模型,分别对生猪价格、玉米价格和豆粕价格进行趋势预测,采用灰色关联度建立猪粮比价与其影响因素的关系模型,利用地理信息系统技术(Arc GIS软件)进行猪粮比价风险等级评估.结果显示,豆粕价格可作为猪粮比价的计算因素,GM(1,1)模型可实现各因素价格预测,灰色关联法可以较为准确预测猪粮比价,同时利用地理信息系统技术能够实现猪粮比价数据管理和风险等级评估的可视化. 展开更多
关键词 猪粮比价 趋势预测 ARC GIS
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猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用 预览 被引量:1
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作者 李彬 杜露平 +13 位作者 何孔旺 刘浩飞 温立斌 张雪寒 郭容利 茅爱华 倪艳秀 周俊明 吕立新 俞正玉 王小敏 胡屹屹 祝昊丹 于洋 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期460-463,共4页
为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其... 为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29%,表明该方法的重复性较好。对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2%。本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具。 展开更多
关键词 猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR 检测
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猪肺炎支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立 预览 被引量:6
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作者 车巧林 熊祺琰 +3 位作者 冯志新 张旭 刘茂军 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第5期1069-1073,共5页
为了建立一种用间接免疫荧光技术检测猪肺炎支原体黏附宿主细胞的方法。以抗猪肺炎支原体单克隆抗体为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG为二抗,通过对一抗、二抗工作浓度的优化确定合适的抗体浓度;通过以1×107CCU/ml... 为了建立一种用间接免疫荧光技术检测猪肺炎支原体黏附宿主细胞的方法。以抗猪肺炎支原体单克隆抗体为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG为二抗,通过对一抗、二抗工作浓度的优化确定合适的抗体浓度;通过以1×107CCU/ml猪肺炎支原体与PK15细胞作用不同时间,确定其黏附细胞需要的时间;通过不同滴度的猪肺炎支原体与PK15细胞37℃作用4 h,确定其黏附细胞需要的滴度。猪肺炎支原体单克隆抗体P463G11的最适工作浓度为1∶1 000倍稀释,FITC-羊抗小鼠IgG的最适工作浓度为1∶200倍稀释,猪肺炎支原体黏附PK15细胞需要的时间为4 h以上,黏附PK15细胞需要的滴度为1×105CCU/ml以上。表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 黏附 间接免疫荧光
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苏淮猪和外来品种猪肺炎支原体血清抗体变化规律研究 预览
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作者 毛爱民 华利忠 +5 位作者 冯志新 范锋 邹建波 姚黄江 缪剑岭 胡明英 《兽医导刊》 2019年第16期223-224,245共3页
本文通过检测不同周龄苏淮育肥猪和外三元猪、不同胎次苏淮母猪和二元猪血清中猪肺炎支原体抗体,调查苏淮猪与外来品种猪在自然感染猪肺炎支原体的情况下血清抗体的变化规律。结果发现:育肥猪群中,苏淮育肥猪和三元猪的猪肺炎支原体抗... 本文通过检测不同周龄苏淮育肥猪和外三元猪、不同胎次苏淮母猪和二元猪血清中猪肺炎支原体抗体,调查苏淮猪与外来品种猪在自然感染猪肺炎支原体的情况下血清抗体的变化规律。结果发现:育肥猪群中,苏淮育肥猪和三元猪的猪肺炎支原体抗体阳性率在4周龄以内均有下降趋势,但7周龄以后均随周龄的增加而升高,且除20周龄外,苏淮猪在其余各个周龄阶段猪肺炎支原体阳性率均高于三元猪。母猪群中,苏淮母猪和二元母猪的猪肺炎支原体血清抗体均随着胎次的增加而下降,但无论哪个胎次,两品种猪之间比较,差异均不显著。结论:育肥猪群中,年龄、品种是猪肺炎支原体抗体变化的影响因素;母猪群中,胎次是猪肺炎支原体抗体变化的影响因素,该结果为临床不同品种、不同猪群猪支原体肺炎防治方法提供依据。 展开更多
关键词 苏淮猪 猪肺炎支原体 血清抗体 检测 风险因素
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猪鼻支原体表面可变脂蛋白VlpB黏附宿主细胞功能研究 预览
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作者 胡永婷 张必雄 +3 位作者 王佳 冯志新 邵国青 熊祺琰 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期1049-1054,共6页
猪鼻支原体表面可变脂蛋白(Vlp)家族在黏附宿主细胞中起重要作用。为研究Vlp家族成员VlpB的黏附细胞功能,包括不同区段的黏附能力,以及其Ⅲ区重复片段的重复次数对黏附能力的影响。本研究利用间接免疫荧光和微孔板黏附试验验证了VlpB的... 猪鼻支原体表面可变脂蛋白(Vlp)家族在黏附宿主细胞中起重要作用。为研究Vlp家族成员VlpB的黏附细胞功能,包括不同区段的黏附能力,以及其Ⅲ区重复片段的重复次数对黏附能力的影响。本研究利用间接免疫荧光和微孔板黏附试验验证了VlpB的黏附细胞能力。然后根据GenBank中登录的vlpB基因序列,构建了仅含Ⅱ区基因的重组质粒pET-32a(+)/vlpBn,诱导表达后纯化,获得纯度较高的重组蛋白Vlp B0;同时化学合成Ⅲ区重复片段PepVlpB并与KLH偶联;进一步合成Ⅲ区重复次数分别为3、6、9、12的一系列vlpB基因,构建pET-VlpB,诱导表达获得相应的重组蛋白VlpB3、VlpB6、VlpB9和VlpB12。利用微孔板黏附试验定量检测上述重组蛋白和偶联蛋白的细胞黏附能力。结果显示,仅含Ⅱ区的重组蛋白Vlp B0及含Ⅲ区重复片段的偶联蛋白KLH-PepVlpB可黏附宿主细胞;比较不同Ⅲ区重复次数的VlpB蛋白的黏附水平,结果显示,随着Ⅲ区重复次数增多,VlpB黏附能力逐渐下降。本研究证实Vlp B作为猪鼻支原体的黏附因子之一,其Ⅱ区和Ⅲ区均含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随Ⅲ区重复次数增加而降低。本研究结果为猪鼻支原体黏附及致病机制研究提供启示。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 可变脂蛋白B(vlpB) 黏附能力 重复次数
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